IMMUNOHISTOCHEMICAL ANALYSIS OF LIVER TISSUE IN EXPERIMENTAL CHEMICALLY-INDUCED FIBROSIS

Full Text

Фиброз печения является широко распространен- как органические, так и неорганические соединения. ным заболеванием. Среди основных причин фиброза Среди токсикантов, обладающих гепатотоксическим печени выделяют хроническую интоксикацию, вирус- и фибротическим действием, находятся хлорированные гепатиты и неалкогольный стеатогепатит [4]. ные углеводороды, спирты, альдегиды, гидразины, фу- Перечень химических веществ, вызывающих раны, соли металлов. Данное заболевание сопровож-фиброз печени, достаточно велик и включает в себя дается снижением всех основных функций органа, 96 Выпуск 1 (53). 2015 jDseunpGs [ЩішііПМЩ а при прогрессировании трансформируется в цирроз с дальнейшей малигнизацией. В диагностике и оценке эффективности терапии при фиброзе печени используются методы исследования молекулярных механизмов образования внеклеточного матрикса, процессов его синтеза и деградации. Кроме того, все более пристальное внимание уделяется вопросу регенерации печеночной ткани после повреждения и путем стимуляции этого процесса [1]. В норме внеклеточный матрикс (ВКМ) в очень небольших количествах присутствует во внеклеточной среде печеночной ткани. Количество матрикса регулируется металлопротеиназами (ММР) большой группой ферментов цинк-зависимых эндопептидаз, способных расщеплять избыточный матрикс [2]. Основная биологическая функция ММР заключается в удалении компонентов внеклеточного матрикса. В неизмененной ткани печени, в свою очередь, активность металлопротеиназ регулируется ингибиторами группы TIMPs (tissueinhibitorsofmatrixmetalloproteinases), среди которых наиболее активен TIMP-1, и в меньшей степени TIMP-2, TIMP-3 и TIMP-4. Нарушение равновесия в системе ММР-TIMPs в сторону снижения активности ММР и повышения активности TIMPs приводит к неконтролируемому отложению внеклеточного матрикса в ткани печени [3]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Изучить изменение металлопротеиназной активности и число активированных звездчатых клеток печени. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ 1. Моделирование фиброза печени Эксперимент проводили на беспородных белых крысах-самцах весом 220-270 г. Крыс содержали в клетках по 8 особей в каждой в помещениях с искусственным освещением (8.00-20.00 - свет, 20.00-8.00 - темнота) при 20-22 оС в условиях свободного доступа к воде и пище. Животные были поделены на две группы: контроль и опыт. При моделировании фиброза печени на белых крысах принималось во внимание наличие у них мощной репаративной системы, поэтому первостепенное значение придавалось стойкости фибротических изменений [4, 5]. В связи с этим нами была выбрана модель фиброза с хроническим введением четыреххлористого углерода (ЧХУ) на фоне постоянной алкоголизации. Эксперимент проводили по следующей схеме. За 7 дней до начала введения ЧХУ животным в качестве питья начинали давать 5%-й водный раствор этанола adlibitum. Раствор ЧХУ в растительном масле в соотношении 1 : 3 вводили внутрижелудочно через зонд дважды в неделю в дозе 0,1 мл/100 г массы тела в течение 8 недель. В течение всего периода индуцирования фиброза печени крысам в качестве питья давали 5%-й раствор этанола. По данным патогистологического исследования, у подопытных животных развивался выраженный фиброз печени с наличием порто-портальных и порто-центральных септ и образованием ложных долек (рис. 1). Степень фиброза печени по шкале METAVIR составляла 3 балла. Рис. 1. Ткань печени крысы через 8 недель после начала эксперимента. Внутрижелудочное введение ЧХУ и этанола. Фиброзные порто-портальные и порто-центральные септы. Образование ложных долек. Баллонная дистрофия гепатоцитов. Окраска по Masson. Ув. х 60 2. Гистохимическое исследование Материалом для гистохимического исследования служила ткань печени интактных и подопытных животных. Определение активности и локализацию белков из группы металлопротеиназ и их ингибиторов проводили на парафиновых срезах с использованием иммуно-гистохимических методов. В их основе лежит высокоспецифичная реакция антиген (исследуемые белки) - антитело (полученные в лабораторных условиях высо-коочищенные препараты). Реакция визуализируется с помощью включения в комплекс антиген-антитело третьего агента, несущего цветную метку. Эту метку наблюдают под световым микроскопом. Было изучено содержание в ткани печени следующих веществ: - металлопротеиназы (ММР) ММР-1, ММР-3, ММР-9; - тканевые ингибиторы металлопротеиназ (TIMP) TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3; - парафиновые срезы образцов тканей, подлежащих иммуногистохимическому исследованию толщиной 5-7 мкм, их монтировали на стекла, обработанные поли^-лизином («Menzel»); - актин цитоплазмы гладкомышечных клеток (α-SMA) в качестве маркера актина ЗК. Для блокирования эндогенной пероксидазы срезы инкубировали 20 минут в 3%-й перекиси водорода. Постановку иммуногистохимической реакции проводили с помощью пероксидаз-полимерной системы визу Выпуск 1 (53). 2015 97 ализации по стандартному протоколу (RE7150-K «Novocastra»). Демаскировку антител осуществляли путем кипячения срезов при 100 оС в цитратном буфере с рН = 6,0 в течение 10 минут. Пероксидазу проявляли 3-3-диаминобензидином из набора протокола. На заключительном этапе реакции срезы докрашивали гематоксилином Майера. В качестве негативного контроля служили препараты без инкубации в первичных антителах при полном соблюдении остальных этапов протокола. О специфическом связывании антител с исследуемыми антигенами ММР-1 и ММР-9 свидетельствовало мелкогранулярное дисперсное окрашивание цитоплазмы клеток (темно-коричневого цвета). Крупнозернистый продукт реакции был характерен для ММР-3, TIMP-1 и TIMP-3. Все полученные препараты изучали на микроскопе Axiostarplus (CarlZeiss) и фотографировали цифровой камерой Canon 10X. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ При иммуногистохимическом исследовании ме-таллопротеиназ было выявлено следующее: - уровни экспрессии ММР-1 и ММР-3 соответствовали контрольным значениям. Гепатоциты с продуктом реакции ММР-3 в виде крупных гранул располагались преимущественно вдоль фиброзных септ (рис. 2); Рис. 3. Ткань печени крысы через 8 недель после начала эксперимента. Внутрижелудочное введение ЧХУ и этанола. Иммунопозитивные клетки с высокой экспрессией, расположенные вдоль фиброзных тяжей. ПАП-метод, антитела к ММР-9. Докраска гематоксилином. Ув. х 340 При иммуногистохимическом исследовании TIMP-1 и TIMP-3 было обнаружено следующее: - фоновый уровень экспрессии как TIMP-1, так и TIMP-3 не изменялся в 60 % случаев, в 40 % случаев активность фермента возрастала в 1,5- 2,0 раза. Выявлялись гепатоциты с сильно положительной реакцией преимущественно вдоль фиброзных септ (рис. 4 и 5), субкапсулярно (рис. 6), а также в местах образования ложных долек. Единичные клетки по морфологическим признакам определялись как тучные. Рис. 2. Ткань печени крысы через 8 недель после начала эксперимента. Внутрижелудочное введение ЧХУ и этанола. Продукт иммуногистохимической реакции в виде крупных ранул в цитоплазме гепатоцитов, расположенных вдоль фиброзных тяжей. ПАП-метод, антитела к ММР-3. Докраска гематоксилином. Ув. х 340 - уровень активности ММР-9 превышал контрольные значение в среднем в 1,5-2,0 раза. Многочисленные иммунопозитивные клетки (некоторые из них, предположительно, тучные клетки) располагались вдоль фиброзных тяжей, а также были рассеяны по паренхиме органа (рис. 3). Рис. 4. Ткань печени крысы через 8 недель после начала эксперимента. Внутрижелудочное введение ЧХУ и этанола. Иммунопозитивная клетка, расположенная в месте образования фиброзного тяжа. ПАП-метод, антитела к TIMP-1. Докраска гематоксилином. Ув. х 340 98 Выпуск 1 (53). 2015 Рис. 5. Ткань печени крысы через 8 недель после начала эксперимента. Внутрижелудочное введение ЧХУ и этанола. Ложная печеночная долька с высоким уровнем экспрессии. ПАП-метод, антитела к TIMP-1. Докраска гематоксилином. Ув. х 8 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Данные иммуногистохимического исследования объясняют интенсивное отложение внеклеточного матрикса резким (в два раза) подъемом активности одной из металлопротеиназ-ММР-9, при слабой индукции - TIMP-1 и TIMP-3. Таким образом, в данном эксперименте процессы синтеза внеклеточного матрикса преобладали над процессами его деградации.

About the authors

I. A. Dvoryashina

Email: germionna@yandex.ru

Yu. I. Velikorodnaya

A. Ya. Pocheptsov

V. L. Zagrebin

References

Supplementary files