EXPERIMENTAL MODEL OF DIABETIC NEPHROPATHY IN RATS

Full Text

Ведущим метаболическим фактором, запускающим каскад патологических изменений в клетках клубочков и канальцев почек при сахарном диабете (СД), является гипергликемия. Она индуцирует неферментативное гликозилирование (гликирование) белков, окислительный стресс, активирует протеинкиназу С, мито- ген-активирующую протеинкиназу, действие факторов роста, цитокинов, вызывающих повреждение почек на уровне клетки [1, 4]. Гликирование белков базальной мембраны почечных клубочков (коллаген IV типа, ламинин, гепарансульфат и др.) приводит к изменению их структуры и свойств, утолщению базальной мембраны сосудов клубочка, расширению мезангиального матрикса, снижению уровня гломерулярной фильтрации, что предшествует таким необратимым процессам, как гло- мерулосклероз и тубулоинтерстициальный фиброз, которые характеризуют финальные стадии развития нефропатии [9]. В настоящее время в клинической практике нет препаратов, способных ингибировать образование конечных продуктов гликирования в организме, поэтому экспериментальное изучение веществ, которые могут оказывать патогенетическое действие на течение осложнений СД, является актуальным. В настоящее время разработано достаточно большое количество экспериментальных моделей СД, которые могут быть индуцированы химическими диабетогенными веществами, диетическими или хирургическими манипуляциями или сочетанием этих способов, а также генетически обусловлеными [7]. Для воспроизведения СД чаще всего используются модели на взрослых крысах, индуцированные химическими цитотоксическими диабетогенными веществами - стрептозотоцином, аллоксаном, дек- саметазоном и др., а также нарушением характера питания (например, содержание животных на рационе с высоким содержанием жиров), либо сочетанным воздействием химических и диетических факторов: стрептозотоциновый диабет с одновременным или предварительным введением никотинамида; стреп- тозотоциновые модели на фоне высокожировой диеты и т. д. [3, 6]. Для скрининга и детального изучения веществ, оказывающих патогенетическое действие на лечение осложнений сахарного диабета наиболее подходящей является модель стрептозотоцин-индуци- рованного диабета [2, 5], вследствие способности стрептозотоцина накапливаться в р-клетках поджелудочной железы, что приводит к стойкой гипергликемии, необходимой для формирования диабетической нефропатии [10]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Воспроизведение экспериментальной модели диабетической нефропатии у крыс при длительной гипергликемии, вызванной стрептозотоциновой интоксикацией. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты проводили на 50 половозрелых беспородных крысах-самцах массой 200-230 г, которых содержали в условиях вивария ВолгГМУ с естественным световым режимом на полнорационной сбалансированной по содержанию питательных веществ диете для лабораторных животных, согласно ГОСТ Р50258-92. Исследования были одобрены Этическим комитетом ВолгГМУ (протокол № 191-2014 от 25 февраля 2014 г.). Экспериментальный сахарный диабет моделировали путем однократного внутривенного введения стреп- тозотоцина («Sigma», США), растворенного в 0,1 М цит- ратном буфере с рН 4,5 в дозе 45 мг/кг [2]. Количественное определение глюкозы в крови проводили на 3-и сутки после введения цитотоксина и далее еженедельно, в утреннее время, натощак, в течение всего срока эксперимента длительностью 12 недель, с использованием глюкометра «Глюкокард» (Россия). В эксперимент брали животных с уровнем глюкозы натощак более 17 ммоль/л. В случае превышения значения гликемии натощак уровня 20 ммоль/л животным вводили инсулин длительного действия «ЛантусСолоСтар», Франция (подкожно). В ходе исследования оценивали массу тела всех экспериментальных животных-исходно и далее еженедельно. Каждые 4 недели крыс помещали на 24 часа в метаболические камеры для сбора мочи с целью исследования суточной экскреции альбумина (колориметрическим методом с бромфеноловым синим «Vital Diagnostics», (Россия). Креатинин сыворотки крови (с последующим расчетом клиренса креатинина) определяли методом Яффе с использованием набора «Pliva-Lachema» (Чехия); уровень гликированно- го гемоглобина определяли с использованием набора «Фосфосорб», (Россия). Для проведения гистологического исследования материал, полученный из почек, фиксировали в течение 24 часов в 10%-м растворе нейтрального забуфе- ренного формалина (pH 7,4), обезвоживали и заливали в парафин по общепринятой гистологической методике. На роторном микротоме изготавливали срезы толщиной 3-5 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином и по Массону. Для проведения иммуногистохимического исследования (ИГХ) использовались моноклональные антитела к фибронектину (GeneTex, F14) и карбоксиметил- лизину (Abcam, CMS-10). Процедуры депарафинизации, демаскировки антигенов, визуализации, окрашивания гематоксилином проводили в соответствии с протоколами фирм производителей антител с последующим анализом иммунофенотипа. Гистологические препараты фотографировали цифровой камерой Axiocam 105 color (Карл Цейс, Германия, 5 мегапикселей) на базе микроскопа Axiocam plus (Карл Цейс, Германия) с использованием объектива х10; х40 и окуляра х10. При морфологическом исследовании оценивали наличие изменений в почечных тельцах (капсула, капилляры, мезангий), изменений соединительной ткани, наличие воспалительной инфильтрации. С помощью морфометрического метода исследования (с использованием программы «ZEN Pro 2012», (Карл Цейс, Германия) определяли площадь почечного тельца (мкм2), площадь соединительной ткани сосудистого клубочка в почечном тельце (мкм2) и относительную площадь соединительной ткани сосудистого клубочка в почечном тельце. Статистическую обработку результатов проводили с использованием табличного редактора Microsoft Excel 2007, программы «GraphPad Prism 5.0», программы STATISTICA 5.0 фирмы StatSoft, Inc., (США) для Windows. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Уровень глюкозы в крови у крыс с СД на 3-й день после введения стрептозотоцина достоверно превосходил в 4,8 раза таковой у интактных животных. Развитие диабета сопровождалось полидипсией, полиурией, животные были вялы и апатичны. На протяжении всего эксперимента уровень сахара в крови у крыс с диабетом оставался достоверно высоким, превосходя значения интактной группы животных (в 4 раза - 1-й месяц, в 6 раз - 2-й месяц, в 3,35 раза - 3-й месяц, р < 0,05) (рис. 1А). Полученные результаты подтверждались статистически значимым увеличением уровня гликированного гемоглобина у крыс со стрептозотоциновой интоксикацией длительностью 3 месяца относительно интактных (в 2 раза, р < 0,05, рис. 1Г). У крыс с патологией к концу исследования отмечали снижение массы тела на 20 % по сравнению с исходной. Каждые 4 недели регистрировали достоверное повышение уровня белка в моче у животных с диабетом по сравнению со значениями интактной группы крыс (в 3 раза - 1 -й месяц, в 2,36 раза - 2-й месяц, в 2 раза - 3-й месяц, р < 0,05) (рис. 1Б), что может быть связано с потерей отрицательной заряженности мембраны почечных клубочков вследствие нарушенного синтеза протеогликанов, входящих в структуру базальной мембраны капилляров [1]. Клиренс креатинина у крыс с сахарным диабетом недостоверно, но увеличивался по сравнению с таковым у интактных животных (в 2,4 ра-за - 1-й месяц, в 1,64 раза - 2-й месяц, в 2,06 раза - 3-й месяц) (рис. 1В), что может происходить в результате гиперфильтрации креатинина и свидетельствовать о развитии ранней стадии диабетической нефропатии. Данное предположение подтверждается увеличением отношения массы почек к массе тела у животных со стрептозотоциновой интоксикацией длительностью 3 месяца на 36 %, по сравнению с интактными животными (рис. 2), что говорит о сопутствующей гипертрофии почек, имеющей место в ранней фазе диабетической нефропатии [8]. А Б В Уровень белка в моче интактных крыс и животных со стрептозотоциновой интоксикацией т 1 месяц 2 месяца 3 месяца Длительность стрептозотоциновой интоксикации ■ контроль интактный ■ стрептозотоциновый диабет *Данные достоверны по отношению к интактному контролю, критерий Манна-Уитни (р < 0,05). Рис. 2. Отношение массы почек к массе тела интактных крыс и у животных со стрептозотоциновой интоксикацией длительностью 3 месяца Морфологическое исследование показало, что в группе животных с сахарным диабетом, по сравнению с контрольной группой, определялось уменьшение размеров почечных телец с дистрофически измененными клетками наружной и внутренней стенок капсулы клубочка, отмечалось очаговое утолщение базальной мембраны капилляров клубочков, расширение мезангия. При проведении морфометрического исследования определялось достоверное уменьшение площади почечных телец на 39 % по сравнению с контрольной группой. Площадь соединительной ткани сосудистого клубочка в почечном тельце достоверно уменьшается на 31 % пропорционально уменьшению площади почечного тельца. Относительная площадь соединительной ткани сосудистого клубочка у животных с сахарным диабетом достоверно увеличивалась на 6 % (табл. 1). При морфометрическом исследовании иммуногистохимических препаратов животных с сахарным диабетом было выявлено увеличение доли фибронектина и карбоксиметиллизина в почечных клубочках (рис. 3, 4) на 33,5 и 14 % соответственно по сравнению с контрольной группой животных (табл. 2). Таблица 1 Морфометрические показатели почечных клубочков Г руппы Показатели площадь почечного тельца, мкм2 площадь соединительной ткани сосудистого клубочка в почечном тельце, мкм2 относительная площадь соединительной ткани сосудистого клубочка Контрольные животные 6267,4 ± 217,3 2979,7 ± 123,8[1] 47,5 Животные с сахарным диабетом 3842,7 ± 144,0 2055,364 ± 79,700* 53,5** *Данные достоверны по отношению к интактному контролю, критерий Манна-Уитни (р < 0,001); **данные достоверны по отношению к интактному контролю, критерий Манна-Уитни (р < 0,01). Таблица 2 Морфометрические показатели почечных клубочков при иммуногистохимическом исследовании Группы Показатели, мкм2 площадь иммунореактивного материала в почечном тельце контрольных животных площадь иммунореактивного материала в почечном тельце животных с сахарным диабетом Фибронектин 1251,8 ± 95,6 1879,8 ± 145,1* Карбоксиметиллизин 791,4 ± 171,4 916,7 ± 157,1 *Данные достоверны по отношению к интактному контролю, критерий Манна-Уитни (р < 0,001). Контрольная группа Группа с сахарным диабетом Рис. 4. Экспрессия иммунореактивного материала с антителами к карбоксиметиллизину окраска гематоксилин-эозином. Ув. х 400 Контрольная группа Группа с сахарным диабетом Рис. 3. Экспрессия иммунореактивного материала с антителами к фибронектину окраска гематоксилин-эозином. Ув. х 400 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что при длительном течении стрептозотоцино- вой интоксикации у крыс формируются ранние проявления диабетической нефропатии. Воспроизведенная экспериментальная модель может быть использована для углубленного фармакологического изучения потенциальных средств профилактики диабетической нефропатии[2]. [1]Работа выполнена за счет средств гранта Российского научного фонда (проект № 14-25-00139). ЛИТЕРАТУРА

About the authors

A. A. Spasov

A. V. Smirnov

O. A. Solovyova

V. A. Kuznetsova

Email: sysoeva_va@mail.ru

N. G. Panshin

A. I. Matsevich

References

Supplementary files