DEVELOPMENT AND VALIDATION OF IMPURITY DETERMINATION TECHNIQUE IN TABLETS OF RU 1205, A NOVEL KAPPA OPIOID AGONIST

Full Text

В настоящее время в области разработки эффективных обезболивающих препаратов одним из перспективных направлений является поиск новых анальгетиков с каппа-опиоидной агонистической активностью, не обладающих наркогенным потенциалом [5]. Такими свойствами обладает новое отечественное соединение РУ 1205 (I), являющееся производным ряда 2,9-дизамещенных имидазо[1,2-а] бензимидазолов [4, 5]. При определении его анальгетических свойств было установлено, что величина обезболивающей активности ED50 соединения I на центральной модели аналгезии, определяющей супраспинальный уровень болевой чувствительности, превосходит буторфанол в 6 раз [6]. По химической структуре I представляет собой дигидрохлорид 2-(4-фторфенил)-9-морфолиноэтилимида- зо^^^бензимидазола (рис. 1). 2HCl С Н Cl FN O 21 23 2 4 В опытно-технологическом отделе ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В. В. Закусова» была разработана твердая дозированная лекарственная форма I-таблетки, покрытые оболочкой (заявка на выдачу патента № 2013144038), проведены исследования по разработке методик ее анализа и, в том числе, методики определения посторонних примесей с помощью высокоэффектив- нойя жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в изократичес- ком режиме [2]. Однако при дальнейших исследованиях было показано, что разработанная методика не позволяет полностью разделить пики извлечения из плацебо и пик одной из технологических примесей I, из-за чего ошибка определения этой примеси возрастает. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Разработать методики определения посторонних примесей с помощью ВЭЖХ, которая могла бы позволить провести идентификацию и количественную оценку содержания известных технологических примесей в таблетках I. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Экспериментальная часть. Исследования проведены на серийных образцах таблеток I 10 мг, покрытых оболочкой, разработанных в лаборатории готовых лекарственных форм опытно-технологического отдела ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В. В. Закусова». Теоретическая масса таблетки - 0,210 г. Таблица 1 Время, мин Стадия Фаза А, % Фаза Б, % 0 Начало анализа 100 0 4 Начало градиента 100 0 7 Конец градиента 0 100 20 Конец анализа 0 100 При проведении исследований использованы серийные образцы субстанции I, синтезированные в ЗАО «ЭМПИЛС-ФОХ», (Ростов-на Дону, Россия) и очищенные путем кристаллизации в опытно-технологическом отделе ФГБНУ «НИИ фармакологии им. В. В. Закусо- ва», а также промежуточные продукты синтеза субстанции I: 2-аминобензимидазол (II), 2-амино-1-морфолино- этилбензимидазол (III) и бромид 2-амино-1-морфолино- этил-3-(4-фторфенацил)бензимидазолия (IV). Свидетели технологических примесей II и III получены в группе технологии синтеза лекарственных средств опытно-технологического отдела ФГБНУ «НИИ фармакологии им. В. В. Закусова», свидетель примеси IV предоставлен ЗАО «ЭМПИЛС-ФОХ», (Ростов-на Дону, Россия). Хроматографический анализ проведен на жидкостном хроматографе Golden System (Beckman Coulter, Inc, США) с градиентным насосом (модель 127) и спектрофотометрическим детектором (модель 166), программное обеспечение - пакет «Мультихром 1.5» (ЗАО Амперсенд, Россия). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Разделения I и свидетелей его технологических примесей, а также компонентов плацебо проведены в градиентном режиме элюирования. Хроматографические условия: стальная колонка длиной 250 мм и внутренним диаметром 4,6 мм, сорбент - Hypersil BDS С18, 5 мкм (Thermo scientific), скорость потока подвижной фазы - 1,0 мл/мин, температура колонки - комнатная, объем пробы - 20 мкл. Буферный раствор: раствор 3,48 г калия фосфорнокислого двузамещенного трехводного в 1000 мл воды для градиентной ВЭЖХ. рН раствора доводили до 7,0 ± 0,5 кислотой фосфорной концентрированной. Подвижная фаза А: смесь 10 мл ацетонитрила для градиентной ВЭЖХ и 110 мл буферного раствора. Подвижная фаза В: смесь 80 мл ацетонитрила для градиентной ВЭЖХ и 40 мл буферного раствора. Подвижные фазы А и Б фильтровали через вакуумную систему фильтрации Bottle-top Vacuum Filter (Corning) с диаметром пор 0,22 мкм и дегазировали. В таблице 1 представлена схема градиента. Аналитическая длина волны, 275 нм соответствовала области совпадения максимумов поглощения примесей и I [3]. В указанных условиях происходило полное разделение I и технологических примесей (рис. 2). Извлечение из плацебо, приготовленное аналогично испытуемому раствору, определению посторонних примесей и I в таблетках I не мешало (рис. 3). Рис. 2. Типичная хроматограмма модельной смеси технологических примесей и I: 1-4 пики плацебо, 5, 6, 7 - пики примесей II, III и IV соответственно в концентрации 0,01 мг/мл, 8 - пик I в концентрации 1 мг/мл 2.29 mV 1 2 3 ............ ..................... /М ^1_ X-_ *_ *_ .. . - . £Ы 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 мин Рис. 3. Хроматограмма извлечения из плацебо Рис. 4. Зависимость площади пика от концентрации I и технологических примесей I и его примеси из таблеток и модельных смесей извлекали смесью метанола для ВЭЖХ и воды для градиентной ВЭЖХ (1 : 1). Схема смены растворителей при градиентном анализе таблеток I Линейная зависимость площади пика от концентрации I подтверждена в пределах интервала от 0,001 до 0,1 мг/мл, примесей II, III и IV-от 0,005 до 0,06 мг/мл, коэффициенты корреляции более 0,998 (рис. 4). х К = Предел обнаружения I составил около 0,002 мкг, примеси II - около 0,01 мкг, примеси III - около 0,01 мкг, примеси IV - около 0,014 мкг. Предел количественного определения I составил- 0,0066 мкг, примеси II - 0,033 мкг, примеси III - 0,033 мкг, примеси IV - 0,0462 мкг. Оценка правильности и сходимости методики была проведена на модельных смесях технологических примесей и плацебо. Около 0,020 г (точная навеска) субстанций технологических примесей помещали в мерную колбу вместимостью 20 мл и добавляли 0,4 г плацебо. В колбу прибавляли около 18 мл смеси метанол для ВЭЖХ- вода для градиентной ВЭЖХ (1:1) и помещали на ультразвуковую ванну на 15 мин. Затем содержимое колбы доводили до метки тем же растворителем, тщательно перемешивали и фильтровали через фильтр «Миллипор» с диаметром пор 0,45 мкм. 1 мл полученного раствора переносили в колбу вместимостью 100 мл, доводили до метки, перемешивали. Количественное определение примесей было проведено с применением поправочных коэффициентов, рассчитанных по формуле: S х С ст х S х С х ст где Сх, Сст - концентрации примеси и стандарта (I) соответственно, в мг/мл; S^ Sct - площади пиков примеси и стандарта (I) соответственно, в единицах интегратора. Поправочные коэффициенты составили 1,031 для примеси II, 2,248 для примеси III и 2,426 для IV примеси. Сходимость методики оценивали, используя расчетные критерии, представленные в «Валидации аналитических методик для производителей лекарств» под ред. В. В. Береговых: средние значения измерений (Хср), стандартные отклонения (S), коэффициенты вариации (RSD) и доверительные интервалы (AX) [5]. Результаты определения правильности и сходимости методики на модельных смесях также представлены в таблице 2. Как видно из таблицы, доверительный диапазон среднего значения для примесей II и IV включает значение 100 %, значения вычисленного коэффициента Стьюдента @выч) не превышают табличные @табл), а следовательно, полученные результаты не отягощены систематической ошибкой и свидетельствуют об удовлетворительной правильности определения примесей II и IV с помощью разработанной методики. Присутствие систематической ошибки (5) в случае определения примеси III, по-видимому, объясняется ее неполным извлечением из модельной смеси с плацебо. Однако величина этой ошибки невелика и не превышает 3,5 %. О сходимости методики позволяют судить значения доверительного интервала (AX, для всех примесей не превышают 2,7 %), а также значения коэффициента вариации (RSD, для всех примесей не превышают 3,5 %). Значения коэффициента вариации не превышают 5 %, что является приемлемым для определения примесей [3, 7]. С применением разработанных условий был определено содержание посторонних примесей в серийных образцах таблеток РУ 1205. Приготовление испытуемых растворов для определения содержания примесей в образцах таблеток проводили следующим образом: около 0,420 г (точная навеска) массы растертых таблеток I переносили в мерную колбу вместимостью 20 мл, прибавляли около 18 мл смеси метанол для ВЭЖХ-вода для градиентной ВЭЖХ (1:1) и помещали на ультразвуковую баню на 15 мин. Затем содержимое колбы доводили до метки тем же растворителем, перемешивали и фильтровали через фильтр «Миллипор» с диаметром пор 0,45 мкм (испытуемый раствор, концентрация I - 1 мг/мл). Результаты определения содержания технологических примесей в модельных смесях Примесь II Примесь III Примесь IV взято (C1), мг/мл найдено (в % от C1) взято (C1), мг/мл найдено (в % от C1) взято (C1), мг/мл найдено (в % от C1) 0,01500 100,99 0,01490 95,91 0,01500 102,94 101,00 93,87 99,00 100,99 98,97 104,9 0,01000 95,00 0,00995 93,46 0,01000 95,97 96,53 96,48 95,00 97,00 97,48 102,00 0,00505 100,66 0,00490 98,32 0,00510 102,33 102,66 96,97 100,00 104,33 98,32 103,33 Метрологические характеристики (P = 95 %, n = 9) Хср ± AX = 99,91 ± 2,42 (%) S = 3,07; RSD = 3,07 % є = 2,42 % tвыч. = 0,09; ^абл. = 2,36 Хср ± AX = 96,64 ± 1,47 (%) S = 1,94; RSD = 2,00 % є = 1,52 % tвыч. = 5,20, "Ьтабл. = 2,36 5 = 3,36 Хср ± AX = 100,61 ± 2,67 (%) S = 3,39; RSD = 3,37 % є = 2,60 % tвыч. = 0,54, "Ьтабл. = 2,36 Таблица 2 x 100 % = В качестве раствора РСО использовали раствор I в смеси метанол для ВЭЖХ - вода для градиентной ВЭЖХ (1:1) с концентрацией I 0,01 мг/мл. Содержание единичной примеси в процентах (Х, %) рассчитывали по следующей формуле: S х m x m х (W - Z) x 20 X[3] [4] [5] [6] [7] [8]_ ст_ ср -_ X_ S x m X C X 20 X 100 x 100 ст нав S х m x m х (W - Z) _ пр_ ст_ ср v_ X_ S X - X С х 100 ст нав где Snp - площадь пика индивидуальной примеси; Sct - площадь пика I на хроматограмме раствора РСО; m - масса навески РСО I, г; m - масса навески таблеток I, г; m - средняя масса таблетки I, г; С - содержание I в одной таблетке, г; W - количественное содержание I в РСО, %; Zct - потеря в массе РСО I, %. Для расчета содержания примеси III, использовался коэффициент 2,25. Типичная хроматограмма извлечения из таблеток I, покрытых оболочкой, представлена на рис. 5. В таблице 3 представлены результаты определения посторонних примесей в образцах таблеток I. В образцах таблеток была обнаружена примесь III, с относительным временем удерживания 0,73 ± 0,3, содержание которой не превышало 0,3 %, а также другие примеси, идентифицировать которые не удалось. Содержание единичной примеси во всех образцах не превышало 0,35 %, а сумма примесей - 0,9 %. Для проверки пригодности хроматографической системы готовили раствор РСО I и примеси II с концентрацией каждого соединения 0,01 мг/мл. Оценку пригодности хроматографической системы проводили следующие критерии: относительное стандартное отклонение результатов отдельных измерений площадей пика I (RSD), число теоретических тарелок (N), коэффициент ассиметрии пика I (Q) и относительное время удерживания примеси II (относительно времени удерживания I) в растворе для проверки пригодности хроматографической системы (t отн.). Результаты представлены в таблице 4. 8.95 mV Таблица 4 Параметры и критерии пригодности хроматографической системы Результаты определения параметров пригодности хроматографической системы (среднее ± доверительный интервал) N Q t отн. RSD 27702 + 183 1,16 ± 0,03 0,5940 ± 0,0057 1,55 ± 0,20 % Критерии приемлемости не менее 25000 не более 1,2 0,59 ± 0,01 не более 2 % Таблица 3 Результаты определения посторонних примесей в таблетках РУ 1205 Относительное время удерживания Содержание посторонних п римесей, % 20213 30213 40213 50213 60213 0,378 - - 0,0337 0,0257 - 0,411 - - - - 0,0393 0,688 0,0076 0,0107 - 0,0136 - 0,730 Примесь III 0,2951 0,2691 0,2689 0,2114 0,1767 0,831 0,0213 0,0184 0,0015 0,0181 0,0166 0,871 0,0580 0,0552 0,0199 0,0303 0,2631 0,971 0,0641 0,0537 0,0383 0,0333 0,0377 1,050 0,3144 0,3208 0,2960 0,2897 0,2933 1,070 0,0351 0,0215 0,0245 0,0166 0,0438 1,145 0,0351 0,0307 0,0245 0,0227 0,0226 1,200 0,0259 0,0184 0,0184 0,0136 - Сумма примесей, % 0,8566 0,7985 0,7257 0,6569 0,8931 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Ц12 13 14 Согласно полученным данным были установлены следующие критерии пригодности хроматографической системы: число теоретических тарелок-не менее 25000; коэффициент асимметрии пика I - не более 1,2; относительное время удерживания примеси II - 0,59 ± 0,01 и относительное стандартное отклонение результатов отдельных измерений площадей пика I - не более 2 %. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В результате проведенных исследований была разработана методика определения посторонних примесей в серийных образцах таблеток I методом градиентной ВЭЖХ, позволяющая полностью разделить I, II, III, IV, а также другие неидентифицированные примеси и компоненты плацебо. Определены валидационные характеристики методики: линейность и диапазон применения, пределы обнаружения и количественного определения примесей. Установлены критерии пригодности хроматографической системы. На модельных смесях технологических примесей и плацебо показано, что методика обладает приемлемой правильностью и сходимостью. С помощью разработанной методики был проведен анализ серийных образцов таблеток таблеток I, который показал присутствие в образцах примеси III в содержании, не превышающем 0,3 %. Также в образцах были обнаружены другие примеси, идентифицировать которые не удалось. Содержание индивидуальной примеси не превышало 0,35 %, а суммарное содержание примесей - 0,9 %.

About the authors

A. A. Illarionov

Email: otopharm@mail.m

L. N. Grushevskaya

L. M. Gaevaya

N. I. Avdyunina

B. M. Pyatin

K. V. Alekseev

I. V. Bogunova

References

Supplementary files