PINEALECTOMY INCREASES THE RISK FOR DEVELOPING BEHAVIORAL DISTURBANCES AND HEMATOLOGICAL DISORDERS IN RATS WITH EXPERIMENTAL ARTHRITIS

Abstract

Pinealectomized rats developed behavioral disturbances and had elevated inflammation-related hematological parameters which resulted in adjuvant arthritis. This may be related to the deficit of psychotropic and anti-inflammatory activity of the main pineal hormone, melatonin.

Full Text

Согласно результатам многочисленных исследований последних лет, основной гормон мозговой железы эпифиза мелатонин обладает интересным сочетанием противовоспалительных и болеутоляющих свойств. Одновременно показана его способность оказывать стабилизирующее влияние на психоэмоциональный статус животных и человека [1, 2, 5]. С другой стороны, по данным клинических наблюдений, такая распространенная ревматоидная патология, как артрит сопровождается, наряду с воспалением суставов, не только болевым синдромом, но и изменениями в психической сфере больных [6]. В этой связи представлялось интересным изучить влияние эпифиза на проявления ревматоидного артрита. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Изучение влияния хирургического удаления эпифиза на поведенческие нарушения и гематологические сдвиги, возникающие у крыс при моделировании экспериментального ревматоидного артрита. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Опыты выполнены на 33 нелинейных крысах - самцах массой 180-220 г, которые содержались в обычных условиях вивария при свободном доступе к пище и воде. Все эксперименты проводились с соблюдением международных принципов Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей. У 11 животных под наркозом (золетил 5 мг/кг, внутримышечно) производили удаление эпифиза по методу, разработанному в нашей лаборатории. Контролем для этой серии служили ложно оперированные животные, у которых трепанировали череп, повреждали твердую мозговую оболочку, приподнимали костный лоскут без последующего удаления железы. Через 5 суток после операции у всех животных моделировали ревматоидный артрит путем однократной инъекции под кожу правой задней конечности (субплантарно) 0,1 мл адьюванта Фрейнда (АФ) (Pierce Biotechnology, США). До начала исследования, через 5 и 14 суток после эпифизэктомии из хвостовой вены крыс в вакутейнеры фирмы «DNK» (Тайвань) забирали кровь (не менее 0,5 мл). В образцах крови определяли следующие показатели: С-реактивный белок (СРБ) - методом иммуно- турбодиметрии реагентом CRPL3 на биохимическом модуле анализатора Cobas 6000, число лейкоцитов - автоматически на гематологическом анализаторе Sysm^x ХГ-2000, ревматоидный фактор класса М (РФ) - методом двухстадийного иммуноферментного анализа реагентом «ДС-ИФА-RF-M» с использованием спектрофотометра ImmunoChem-2100 Hicroplate Reader, уровень циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) оценивали с помощью набора реагентов «ЦИК-ХЕМА» методом иммунного турбодиметрического анализа на том же спектрофотометре, уровень плазменного мелатонина определяли методом двухстадийного иммуноферментного анализа на спектрофотометре ImmunoChem-2100 Hicroplate Reader, уровень кортизола определяли с помощью электрохемилюминесцентного теста «ECLIA- ЭХЛА», который основан на принципе конкуренции с применением поликлональных антител, специфичных к кортизолу, на иммунохимическом анализаторе Cobas 6000. Оценку поведенческих сдвигов производили с помощью традиционных методик «открытого поля» (ОП) и приподнятого крестообразного лабиринта (ПКЛ). ОП - это арена стандартного размера, в которой на протяжении 5 мин учитывали горизонтальную (по числу пересеченных сегментов арены) и вертикальную (число вертикальных стоек) двигательную активность. ПКЛ представлял собой расположенную на высоте (50 см от пола) крестообразную установку с открытыми и закрытыми рукавами. Его применяли для определения степени тревожности и исследовательской активности крыс. Критерием первой служила длительность пребывания животных в том и другом рукаве, тогда как учет числа вертикальных стоек и свешива- ний с горизонтальной платформы позволял судить об уровне исследовательского поведения. Полученные результаты обработаны с использованием парного критерия Стьюдента и однофакторного дисперсионного анализа посредством пакета компьютерных программ BIOSTAT. Различия считались достоверными при р < 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Адъювантный артрит проявлялся выраженными отеками мягких тканей стопы, сустава, повышалась локальная температура. Отмечалось снижение объема движений в суставах и выраженная болезненность при их пальпации. Наряду с этим зарегистрировано некоторое падение горизонтальной двигательной активности в ОП, а в ПКЛ достоверное (практически в 2 раза) снижение времени, которое животные проводили в открытом рукаве (р < 0,05), что указывало на возрастание тревожности (табл. 1). Адъювантный артрит у животных с ЛО проявлялся в некотором ограничении локомоции и исследовательского поведения в ОП и достоверном нарастании уровня тревожности в ПКЛ (p < 0,05). ЭЭ значительно утяжеляла течение артрита у крыс. Веским аргументом тяжести состояния служил 50%-й показатель гибели животных этой группы. В ОП через 14 суток после моделирования артрита отмечалось более значимое снижение числа пересеченных сегментов и стоек (на 35 и 58 %) в сравнении с ЛО (на 20 и 30 % соответственно). У животных нарастала тревожность, судя потому что время в открытом рукаве ПКЛ достоверно сократилось, с (14,6 ± 2,14) до (9,5 ± 1,4) с. Зафиксировано ограничение исследовательской активности в виде уменьшения стоек и све- шиваний в ПКЛ (табл. 1). Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что ЭЭ утяжеляет поведенческие и психоэмоциональные нарушения у животных с АА. Гематологические показатели. Введение АФ вызвало выраженный воспалительный процесс, о чем свидетельствовал значительный лейкоцитоз и резкое увеличение в крови уровня СРБ (табл. 2). У животных с ЛО выявлены аналогичные сдвиги, тогда как после ЭЭ гораздо резче повышался лейкоцитоз и уровень СРБ (оказался в 2 раза выше, чем в группах с артритом и ЛО). Эти явления сопровождались существенным нарастанием в крови уровня ЦИК и РФ. Таблица 1 Группа животных Показатели Исходные данные Через 5 суток после ЭЭ Через 14 дней после АА «Открытое поле» АА ГДА 12,75 ± 4,92 12,5 ± 1,04 10,5 ± 1,34 ВДА 4,75 ± 1,77 3,0 ± 1,29 3,0 ± 0,91 АА+ЛО ГДА 15,33 ± 1,91 12,38 ± 1,82 9,25 ± 1,6 ВДА 6,88 ± 1,06 4,8 ± 0,93 4,75 ± 0,49 АА+ЭЭ ГДА 12,12 ± 1,78 8,5 ± 1,87' 5,8 ± 0,58 + ВДА 5,12 ± 0,98 2,16 ± 0,54' 2,0 ± 0,36' Приподнятый крестообразный лабиринт АА Открытый рукав 248,8 ± 10,9 248,8 ± 10,9 105,8 ± 15,3 Вертикальные стойки 6,5 ± 1,2 6,5 ± 1,2 8,25 ± 0,73 АА+ЛО Открытый рукав 52,1 ± 8,76 27,7 ± 3,38+ 15,6 ± 1,29+ Вертикальные стойки 16,91 ± 2,02 12,4 ± 1,49+ 7,2 ± 1,39+ АА+ЭЭ Открытый рукав 50,6 ± 12,06 14,6 ± 2,14'+ 9,5 ± 1,4'+ Вертикальные стойки 15,7 ± 2,03 7,35 ± 1,06' 6,0 ± 1,18+ Примечание. ГДА - горизонтальная двигательная активность, ВДА - вертикальная двигательная активность, АА - адъювантный артрит, ЛО - ложная операция, ЭЭ - эпифизэктомия. 'Достоверность разницы по сравнению с ЛО, однофакторный дисперсионный анализ, ^достоверность разницы при сравнении с адъювантным артритом. Нарушения поведения животных при адъювантном артрите на фоне хирургического удаления эпифиза Адъювантный артрит сопровождался значительным увеличением плазменной концентрации кортизола. Сравнительный анализ показал, что у животных с сохранным эпифизом его уровень был значимо ниже, чем у эпифизэктомированных крыс. Динамика изменений содержания мелатонина в плазме имела обратную картину (рис.). 350 300 250 200 150 100 50 □ Мелатонин □ Кортизол 12 3 12 3 Эпифизэктомия Ложная операция 0 Таблица 2 Влияние удаления эпифиза на гематологические показатели животных с адъювантным артритом Показатель Группа животных Исходные данные Через 5 суток после операции Через 14 дней после введения АФ СРБ АА 0,24 ± 0,60 0,24 ± 0,60 33,0 ± 4,1* ЛО+АА 0,29 ± 0,04 1,98 ± 0,40 32,58 ± 2,20 ЭЭ+АА 0,37 ± 0,09 5,34 ± 0,90 63,21 ± 4,60 Лейкоциты, *109/л АА 4,35 ± 0,20 4,35 ± 0,20 31,8 ± 1,2 ЛО+АА 4,52 ± 0,60 8,9 ± 1,6 31,3 ± 1,8 ЭЭ+АА 4,61 ± 0,20 11,5 ± 1,4 45,2 ± 2,4 ЦИК, ЕД АА 20,0 ± 4,1 20,0 ± 4,1 80,0 ± 7,2' ЛО+АА 23,1 ± 4,1 22,9 ± 1,3 87,4 ± 9,3 ЭЭ+АА 19,9 ± 2,3 20,0 ± 2,1 113,2 ± 17,4 РФ, МЕ/мл АА 19,0 ± 2,1 19,0 ± 2,1 35,8 ± 1,2' ЛО+АА 16,7 ± 3,1 15,7 ± 2,1 43,6 ± 1,7 ЭЭ+АА 15,4 ± 2,3 15,5 ± 2,4 78,9 ± 3,1 'Достоверность разницы по сравнению с эпифизэктомированными животными (ЭЭ+АФ), однофакторный дисперсионный анализ. Рис. Влияние эпифизэктомии на гормональный статус животных с адъювантным артритом: 1 - фоновые показатели, 2 - через 5 суток после эпифизэктомии, 3 - через 14 суток после АА. Как свидетельствуют полученные результаты, удаление эпифиза у крыс усугубляет поведенческие нарушения и гематологические показатели воспалительной реакции, сопутствующие адьювантному артриту. Известно, что эпифиз является источником различных биологически активных соединений пептидной и индоль- ной природы, среди которых ведущую роль, несомненно, играет основной гормон железы мелатонин. В настоящее время существует достаточное количество экспериментальных доказательств, чтобы отнести обнаруженные сдвиги за счет специфической недостаточности именно этого гормона. Использованные в данной работе тесты («открытое поле» и крестообразный лабиринт) со всей определенностью указывают на рост тревожного состояния у эпифизэктомированных животных с артритом. Несомненно, поведенческие расстройства при суставной патологии должны носить более сложный характер и дополнительно включать расстройства в аффективной и когнитивной сферах, в чем убеждает оценка той и другой у людей, страдающих ревматоидным артритом [6]. По данным наших предыдущих исследований, экзогенный мелатонин оказывает комплексное воздействие на психоэмоциональную сферу животных, которое определяется не только ограничением тревожности, но и ослаблением депрессивных проявлений, а также улучшением познавательной деятельности мозга [1]. Аналогичным образом усиление гематологических проявлений воспалительной реакции после удаления эпифиза тоже правомерно трактовать как следствие дефицита мелатонина, исходя из существования у него противовоспалительных свойств. Между тем ранее на разных экспериментальных моделях уже отмечалось существование у мелатонина отчетливой противовоспалительной активности, которая определяется, вероятно, комплексом причин, включая нарушение гормоном каскада арахидоновой кислоты за счет блокады активности циклооксигеназы и ограничение окислительного стресса [5, 7, 11]. К этому, безусловно, следует добавить и отчетливое болеутоляющее действие, которое в последние годы обнаружено у эпифизарного гормона [3]. Использованный в данной работе адъювантный артрит, благодаря аутоиммунному происхождению, признается близким по своему генезу ревматоидной патологии у людей. Между тем у мелатонина показана способность вмешиваться и в иммунный статус организма [4]. Вероятно, в первую очередь за счет своей иммуномодуляторной активности мелатонин демонстрирует лечебные возможности и при различных формах аутоиммунной патологии и оказывается эффективен на экспериментальных моделях системной красной волчанки [9], рассеянного склероза [8], атопического дерматита [10]. Отсюда вполне правомерно ожидать терапевтического эффекта и от использования препаратов мелатонина, в том числе при ревматоидном артрите с его аутоиммунной природой. ЛИТЕРАТУРА