RELATIONSHIPS BETWEEN EPITHELIAL AND STROMAL CELLS IN DUCTAL BREAST CARCINOMA

Full Text

В настоящее время взгляд ученых направлен на изучение эпителиально-стромальных взаимоотношений, играющих важную роль в прогрессии эпителиальных опухолей в сторону дедифференцированного, то есть более злокачественного фенотипа [2, 6, 12], при этом рак молочной железы не является исключением. Рак молочной железы (РМЖ) является достаточно агрессивным заболеванием [3, 4]. Несмотря на существенный прогресс, достигнутый в изучении РМЖ и развитии подходов к его комбинированному лечению, выживаемость больных остается на низком уровне, также и страдает качество жизни пациентов [2, 12]. Одной из причин является выраженная десмоп-ластическая реакция стромы опухоли, составляющая до 70-80 % объема опухолевой ткани [1, 3], проявляющаяся в гиперэкспрессии белков внеклеточного матрикса и пролиферацией миофибробластов [7, 11]. Ряд исследований подчеркивают важную роль развитой десмопластической стромы РМЖ в «защите» от хими отерапии опухоли и/или увеличении риска метастази-рования опухолевых клеток [5, 18]. При РМЖ, так же как и при других опухолях, одному из ключевых моментов в прогрессии опухоли отводится эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) [1, 4, 14, 16]. На сегодняшний момент не подлежит сомнению тот факт, что эпителиально-мезенхимальный переход играет ключевую роль в опухолевой прогрессии и метастазировании. Запуск программы перехода дает клеткам явные преимущества, которые способствуют эффективной инвазии и метастазирова-нию в удаленные органы и ткани. ЭМП является основным, хоть и не единственным механизмом, отвечающим за образование метастазов. Приобретая мезенхимальный фенотип, отдельные раковые клетки получают возможность проникать в окружающие ткани, а также преодолевать барьер эндотелия, поступая в кровеносные или лимфатические сосуды [14, 17]. ЭМП - это эволюционно закрепившийся процесс, связанный Выпуск 4 (56). 2015 79 ЩШгорСз [ЩсмеТКЩ с переходом от одноклеточных организмов к многоклеточным и обеспечивающий перемещение эмбриональных клеток, дающих начало новым специализированным тканям и органам. Однако при изменении условий существования тканей в постэмбриональном периоде, при воздействии повреждающих факторов, в процессе канцерогенеза возможна активация генетических программ ЭМП [14, 19]. Известно, что утрата полярности клеток в карциномах ведет к изменению их цитоскелета, при этом одним из признаков ЭМП является утрата клетками ци-токератиновых промежуточных филаментов и приобретение виментиновых. ЭМП сопровождается изменением профилей транскрипции генов, в том числе компонентов цитоскелета и внеклеточного матрикса, а также протеолитических ферментов, участвующих в деградации последнего [4, 13]. Фенотипические изменения ЭМП включают снижение экспрессии белков эпителиальных маркеров (таких как Е-кадгерин, десмоплакин и др.) и появление и/или усиление экспрессии белков мезенхимальных маркеров (виментин, фибронектин, гладкомышечный актин и др.) [9, 10, 15-18]. Изменение микроокружения и утрата полярности могут способствовать снижению дифференцировки опухолевых клеток [19], однако полной утраты тканеспецифических свойств никогда не происходит - при потере дифференцировки эпителиальные опухоли продолжают сохранять часть признаков исходной ткани и способность к редифференцировке [4]. Кроме того, в процессе утраты дифференцировки опухолевых клеток может происходить возобновление синтеза эмбриоспецифических белков, характерных для незрелых клеток [8, 11]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Изучение морфологических свойств анапласти-ческих участков опухоли и окружающей стромы при протоковой карциноме молочной железы. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Выполнен анализ операционного материала от 118 больных протоковым РМЖ, находившихся на лечении в медицинских учреждениях г. Москвы в период с 2009 по 2015 гг. Возраст больных колебался от 40 до 80 лет. Средний возраст пациенток-61 год. Материал изучался с помощью световой и электронной микроскопии, а также с применением иммуно-гистохимических методик. Материал для световой микроскопии фиксировали в 10%-м забуференном растворе формалина, затем заливали в парафин по обычной методике. Серийные парафиновые срезы толщиной 3 мкм депарафинировали по стандартной схеме, затем окрашивали гематоксилином и эозином. Для электронно-микроскопического исследования материал префиксировали в 2,5%-м растворе глутарового альдегида, постфиксировали в 1 %-м растворе ОsО4 (рН 7,4), заливали в смесь аралдита и эпона. Полутонкие срезы окрашивали смесью азура 2 и фуксина. Ультратонкие срезы контрастировали уранилаце-татом и цитратом свинца и изучали в трансмиссионном электронном микроскопе Libra 120 (Carl Zeiss, Германия). Иммуногистохимическое исследование проводили на серийных парафиновых срезах толщиной 2 мкм по стандартой методике с применением следующей панели поликлональных антител: р63, гладкомышечный актин (ГМА), общий цитокератин, цитокератин 7, виментин, Е-кадгерин (Dako, Lab Vision Flex). Интенсивность пероксидазной метки для каждого цитоплазматического оценивали полуколичественным методом с учетом интенсивности окрашивания и количества антиген-по-зитивных клеток. Иммуногистохимическая реакция оценивалась как негативная («-» - нет реакции), слабопозитивная («+» - <10 % окрашенных клеток), умеренная («++» - >10 % клеток средней интенсивности окраски) и выраженная («+++» - >50 % клеток высокой интенсивности окраски). Для проведения ИГХ-реак-ции применялась техника tissue microarrays (TMA), сконструированная в формате multitumor arrays. Данная модель состояла из 24 образцов первичной опухоли от разных больных, при этом от одного больного использовались образцы с разной степенью дифференциров-ки опухолевых клеток. Таким образом, это позволило осуществить скрининг определенного молекулярного повреждения во всем разнообразии представленных опухолей с наименьшей затратой реактивов и времени. Для получения цветного изображения использовали сканер Mirax desk (Zeiss). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Макроскопически протоковый рак молочной железы имеет вид узла неправильной формы без четких границ, размерами от 2 до 10 см, на разрезе матового белесовато-серого или беловато-желтого цвета, плотноватой консистенции (рис. 1). Нередко в центре опухоли можно обнаружить очаги распада с формированием полостей различной формы. Рис. 1. Макроскопическая картина протокового рака молочной железы. Гетерогенность макроскопических проявлений 80 Выпуск 4 (56). 2015 ©шПГ МШ В результате цитологического исследования мазков-отпечатков с опухоли выявлены патогномоничные цитологические признаки, характерные для протоковой карциномы молочной железы. Это группы мелких моно-морфных клеток, часто формирующих «веерообразные» структуры вокруг тонких фиброваскулярных стержней, наличие в некоторых ядрах продольных борозд (рис. 2). Рис. 2. Цитологическая картина протоковой карциномы молочной железы. Окраска по Паппенгейму, ув. х 900 Микроскопически в большинстве случаев, 78,8 % (93/118), опухоль представлена железистыми структурами неправильной формы, выраженной дес-мопластической реакцией стромы, как правило, занимающий большой процент площади опухолевой массы (от 50-80 %). Однако в 21,2 % (25/118) случаев в классическом гистологическом варианте протокового РМЖ в опухоли наряду с железистыми структурами обнаружен анап-ластический (саркомо-подобный) компонент, представленный крупными полиморфными или веретенообразными клетками с гиперхромными ядрами, иногда многоядерными, с минимальным стромальным компонентом (рис. 3 а, б). б) Рис. 3 а, б. Светооптическая характеристика протоковой карциномы молочной железы с наличием участков анапластического строения. Окраска гематоксилином и эозином. Ув. х 100 Объем анапластического компонента разнился и составил от 5 до 20 % общей массы опухоли, но во всех случаях не являлся преобладающим. При проведении ИГХ реакции обнаружены различия в экспрессии маркеров в железистом и анапласти-ческом компонентах протокового РМЖ. Так, выраженная экспрессия гладкомышечного актина (+++) отмечена только в десмопластической строме, окружающей железистые структуры (рис. 4). а) Рис. 4. Экспрессия актина в десмопластической строме протоковой карциномы МЖ. Иммуногистохимическая реакция. Ув. х 100 В опухолях с анапластическим компонентом также отмечена выраженная положительная реакция с ГМА, выявленная как в гладкомышечных волокнах, так и в единичных крупных анапластических опухолевых клетках. Помимо этого, как в строме, так и в эпителиальном анапластическом компонен- Выпуск 4 (56). 2015 81 ЩШґОрСЗ [Щ<Шг1ПЩ| те отмечена выраженная диффузная реакция с ви-ментином (+++) (рис. 5), отсутствующая в железистых структурах (рис. 6). Рис. 5. Экспрессия виментина в недифференцированном компоненте. Иммуногистохимическая реакция. Ув. х 100 Рис. 6. Экспрессия виментина в железистом компоненте. Иммуногистохимическая реакция. Ув. х 200 Одновременно в отдельных анапластических клетках отмечалась потеря экспрессии общего цитокератина и цитокератина 7 при сохраненной экспрессии эпителиально-мембранного антигена. В ядрах анапластических клеток отмечена положительная реакция с маркером базальных стволовых клеток р63. В опухолях без анапластического компонента процент окрашенных ядер с антителами к р63 был ниже и представлен единично окрашенными ядрами по периферии железистых структур. При раке молочной железы происходила редукция экспрессии белка Е-кадгерина и изменение полярности его экспрессии, а именно исчезновение мембранного окрашивания и появление цитоплазматического с разной степенью интенсивности (рис. 7). В опухолевых клетках железистых структур РМЖ в 66,7 % (62 из 93 случаев) наблюдалось умеренно-выраженная (++) цитоплазматическая экспрессия дан ного белка; в 30,1 % (28/93) - выраженная цитоплазматическая (+++). Мембранная реакция наблюдалась только в 3,2 % (3/93) случаев. В анапластическом компоненте во всех случаях отмечена отрицательная как мембранная, так и цитоплазматическая экспрессия белка Е-кадгерина (рис. 8). Рис. 7. Экспрессия белка Е-кадгерина в протоковом РМЖ. Иммуногистохимическая реакция. Ув. х 100 Рис. 8. Отрицательная мембранная и цитоплазматическая экспрессия белка Е-кадгерина в анапластическом компоненте протоковой карциномы МЖ. Иммуногистохимическая реакция. Ув. х 200 При электронно-микроскопическом исследовании материала клетки протоковой карциномы в анапластическом компоненте имели следующее строение: в цитоплазме многих опухолевых клеток содержались тонкие фибриллы, множественные вакуоли, мелкие везикулы. Встречалось много фибробластоподобных клеток. В строме обнаруживались беспорядочно расположенные тонкие коллагеновые волокна. К клеточной мембране изнутри примыкает такое же тонкозернисто-волокнистое вещество, распространяющееся и вглубь цитоплазмы, между свободными рибосомами и цистернами цитоплазмы. Имея в виду связь рибосомного аппарата с синтезом белка, 82 Выпуск 4 (56). 2015 можно представить себе, что эта ультраструктурная картина являются морфологическим выражением синтеза протофибрилл коллагена и их выведения за пределы клетки. Волокнистое вещество открывается как в цистернах цитоплазмы, так и между ними (рис. 9). Рис. 9. Протофибриллы коллагена в цитоплазме опухолевой клетки протоковой карциномы МЖ. Электронограмма. Ув. х 25000 Следы волокнистого вещества открываются также и в пузырьках аппарата Гольджи, который может располагаться в непосредственной близости к клеточной мембране. Некоторые картины расположения цитоплазматических цистерн позволяют предполагать, что цистерны - цитоплазмы совместно с пузырьками аппарата Гольджи являются органом выведения волокнистого вещества из клетки. Также встречаются крупные светлые опухолевые клетки вытянутой формы, в цитоплазме которых определялось, кроме обычных органелл, большое количество миофибрилл. В отдельных участках можно видеть точечные зоны уплотнения. Клеточная мембрана в части клеток образовывала суб-плазмалеммальные уплотнения и базальную мембрану. Встречались пиноцитозные пузырьки (рис. 10). Рис. 10. Крупные светлые опухолевые клетки вытянутой формы, в цитоплазме которых отмечается большое количество миофибрилл. Электронограмма. Ув. х 15000 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Классический вариант протокового РМЖ по своей гистологической структуре-как правило, неоднородная опухоль, которая представлена полями различной дифференцировки от высокой до низкой, включая анапласти-ческий компонент. В исследуемой серии анапластичес-кий компонент присутствовал в 21,2 % (25/118) случаев. По нашему убеждению, его необходимо выделять даже при минимальном его объеме от общей массы опухоли, поскольку опухоли с анапластическим компонентом имеют не только различия в гистологическом строении, но и в злокачественном потенциале, а также по экспрессии эпителиальных, миоэпителиальных и мезенхимальных им-муно-гистохимических маркеров. Гистологически десмоп-лазия стромы, которая характерна для протокового РМЖ, полностью отсутствует в анапластических участках. Опухолевые клетки, плотно располагаясь друг к другу, как бы создают «стромальный каркас» из самих себя. Кроме того, выявленная в анапластических клетках диффузная экспрессия с виментином, гладкомышечным актином и р63 подтверждает, что в процессе потери диф-ференцировки опухолевые клетки приобретают миоэпи-телиальный и/или мезенхимальный фенотип. Данный факт, вероятно, связан с эпителиально-мезенхимальным переходом в опухоли, основными критериями которого являются утрата эпителиальной полярности, разделение на отдельные клетки и дисперсия при приобретении клеточной подвижности. При этом происходит разрушение плотных адгезионных контактов (редукция и изменение полярности экспрессии Е-кадгерина) и реорганизация комплексов, обеспечивающих прикрепление клетки к субстрату. Однако частично сохраненная экспрессия цитокератинов и эпителиально-мембранного антигена свидетельствует о сохранении цитокеартиновых рецепторов и возможной обратной трансформации при изменении микроокружения. По данным некоторых авторов показано, что ингибирование трансформирующего фактора роста-ß в раке приводит к обратному мезенхимально-эпителильному переходу и потере мезенхимального и восстановлению эпителиального фенотипа [9, 10, 13, 16, 17]. Таким образом, возрастающий интерес исследователей к эпителиально-стромальным взаимодействиям в протоковом РМЖ обусловлен его агрессивным биологическим поведением, резистентностью к химиотерапевтическому лечению и различной выживаемостью в зависимости от дифференцировки опухоли. Гетерогенность протокового рака проявляется в появлении анапластического (саркомоподобного) компонента, в котором прослеживается способность эпителиальных опухолевых клеток приобретать свойство мезенхимальных клеток, не требующих стромы и обладающих агрессивным злокачественным потенциалом, влияющим на выживаемость больных. ЛИТЕРАТУРА 1. Василенко И. В. Морфологические особенности зоны паренхиматозно-стромальных контактов в раке Выпуск 4 (56). 2015

About the authors

M. V. Mnikhovich

FSBSI «Research Institute of Human Morphology»; SFEE HPE «The Pirogov Russian National Research Medical University (RNRMU) of the Ministry of Public Health of the Russian Federation»

Email: mnichmaxim@yandex.ru

References

Supplementary files