OPTIMIZATION OF METHOD IN VITRO FOR RE-GLYCATION ACTIVITY OF COMPOUNDS INVESTIGATION

Full Text

Хроническая гипергликемия является одним из наиболее характерных признаков всех типов сахарного диабета (СД) и приводит к усилению неферментативного гликозилирования белков организма и, как результат, образованию различных конечных продуктов гликирования (КПГ), в которых последовательно формируются необратимые сшивки. Гликирование служит основной причиной спонтанного нарушения структуры белков в организме, а на фоне СД гликирование усиливается за счет повышения уровня глюкозы и других сахаров в плазме крови [3]. КПГ стимулируют различные провоспалительные и сигнальные метаболические пути, а их избыточное накопление в организме рассматривается как главный фактор в патогенезе поздних осложнений СД, преимущественно диабетической ретинопатии и нефропатии, а также некоторых других заболеваний [1]. Так, в настоящее время выделяют несколько подходов к контролю продукции и разрушению КПГ. К первому относится предупреждение процесса гликирования белков и формирования в них поперечных сшивок, что приводит к замедлению прогрессирования диабетических осложнений. Так, к соединениям со свойством подавлять образование КПГ относится аминогуанидин, для которого, тем не менее, клинические испытания были прекращены главным образом из-за его способ ности ингибировать NO-синтазу и прооксидантной активности [2]. Другой подход основан на разрушении поперечных сшивок гликированных белков. В качестве соединений с таким механизмом действия предлагались бромид N-фенацилтиазолия и алагебриум, которые успешно прошли этап доклинических исследований, но по различным причинам их клинические испытания были прекращены [4, 6]. Таким образом, в настоящее время активно уделяется внимание поиску и разработке новых химических соединений, способных ингибировать образование КПГ или разрушать поперечные сшивки гликированных белков с целью создания лекарственных препаратов для профилактики развития поздних осложнений СД. Существует различные как in vitro, так и in vivo методики для оценки способности соединений разрывать сшивки гликированных белков [4, 5]. Для начального этапа скрининга новых соединений одной из доступных моделей является исследование регликирова-ния гликированного бычьего сывороточного альбумина (БСА) in vitro. Для регистрации продуктов в реакционной смеси используют метод определения специфической флуоресценции гликированного БСА при Xex = 370 нм и Xem = 440 нм [5]. 30 = Выпуск 1 (57). 2016 ЦЕЛЬ РАБОТЫ Так, в настоящем исследовании представляется целесообразным настроить экспериментальную модель и оптимизировать условия выполнения метода [5] для изучения регликирующей активности химических соединений in vitro. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Способность соединений регликировать гликиро-ванный БСА in vitro изучали по модифицированному методу [5]. Реакцию гликирования моделировали в реакционной смеси, содержащей 400 мМ глюкозы («Агат-Мед», Россия) и 0,8 мг/мл БСА («BioWest», France), растворенных в 50 мМ фосфатном буферном растворе (рН 7,4). Для предупреждения бактериального роста в буферный раствор вносили азид натрия («Sigma», США) в конечной концентрации 0,02%-й. Смесь инкубировали при 60 °С в течение 40 часов. После окончания инкубации в пробирки типа эппендорф добавляли по 200 мкл смеси (БСА + глюкоза) с прибавлением 20 мкл 100%-й трихлоруксусной кислоты (ТХУ) («Fisher Scientific», США). После центрифугирования при 15000 об./мин в течение 4 мин при 37 °С в осажденный гликированный БСА добавляли до 300 мкл 50 мМ фосфатного буферного раствора (рН 7,4) и 30 мкл изучаемого вещества - реакционный объем 330 мкл - и инкубировали при 60 °С в течение 40 часов. Кроме того, было приготовлено аналогичное количество проб с не-гликированным неосажденным раствором БСА в количестве 300 мкл на каждую пробу, в которое также добавляли исследуемое вещество, и подвергали инкубации. Все вещества растворяли в диметилсуль-фоксиде (ДМСО) («Fisher Scientific», США). В исследуемые образцы добавляли изучаемые вещества в необходимых конечных концентрациях, в контрольные образцы добавляли соответствующий объем растворителя. После окончания инкубации в пробирки добавляли 33 мкл 100 % ТХУ, затем центрифугировали при 15000 об./мин в течение 4 мин при 37 °С. Осажденные гликированный БСА и негликированный БСА растворяли в 1 мл фосфатного солевого буфера (рН 10,0) и определяли специфическую флуоресценцию пробных образцов на микропланшетном ридере («InfiniteM200», «Tecan», Австрия) при Xex = 370 нм и Xem = 440 нм. Способность исследуемых соединений регликировать гликированный альбумин рассчитывали по формуле (1): Ac (%) = ((Fc-Fb) - (Fs-Fsb) / (Fc-Fb))*10 (1) где Fc - флуоресценция инкубированного БСА, глюкозы и ДМСО (контроль); Fb - флуоресценция инкубированного БСА (негликированного); Fs-флуоресценция инкубированных БСА, глюкозы и исследуемого вещества; Fsb - флуоресценция инкубированного БСА (негликированного) и исследуемого вещества. Для оценки адекватности воспроизведения метода был протестирован алагебриум (Kailu Xingli Pharmaceutical Co., Ltd., China), раствор которого добавляли в экспериментальные образцы в концентрациях 7 мМ, 4,5 мМ, 3,5 мМ, 2,5 мМ и 1,25 мМ. Также на данной модели протестировали аминогуа-нидин («Sigma», США), известный ингибитор образования КПГ, в эквимолярных концентрациях от 7 до 1,25 мМ. Статистическая обработка результатов исследования проводилась с применением непараметрического критерия Манна-Уитни, анализа зависимости «доза-эффект» методом линейной регрессии и расчета полу-максимальной ингибирующей концентрации (IC50) в программе GraphPad Prism 6. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Формирование гликированного БСА в реакционной смеси подтверждается наличием характерного пика флуоресценции контрольных образцов при Xex = 370 нм и Xem = 440 нм. В ходе проведенных исследований была подтверждена способность алагебриума, имеющая дозозависимый характер, регликировать БСА, полученный в результате описанной реакции. Показано, что активность алагебриума на данной модели в концентрациях 7 мМ, 4,5 мМ, 3,5 мМ, 2,5 мМ, 1,25 мМ составляет 52,4 %, 43,2 %, 30,9 %, 19,5 % и 17,9 %, соответственно (табл.). На основании полученных данных также был рассчитан параметр IC50 алагебриума, который составил 6,35 мМ (рис.), что соответствует ранее опубликованным данным об активности данного соединения [4]. При этом оптимальной для сравнения эффектов изучаемых веществ между собой в скрининговых исследованиях оказалась концентрация 5 мМ. Рис. Регликирующая активность алагебриума in vitro. Значение IC50 В то же время при тестировании известного ингибитора гликирования белков аминогуанидина на данной модели в эквимолярных концентрациях с ала-гебриумом у него не было обнаружено характерных для алагебриума регликирующих свойств (табл.). Выпуск 1 (57). 2016 31 -iBtegwitufa ЩдгГГОЩ> Регликирующая активность алагебриума и аминогуанидина in vitro в широком диапазоне концентраций 7-1,25 мМ Вещество Регликирующая активность, А % (M ± m) IC50 7 мМ 4,5 мМ 3,5 мМ 2,5 мМ 1,25 мМ Алагебриум 52,35 ± 2,62* 43,23 ± 2,89* 30,88 ± 2,62* 19,46 ± 0,33* 17,87 ± 0,47* 6,35 мМ Аминогуанидин 2,81 ± 0,28 2,76 ± 0,20 2,03 ± 0,78 1,89 ± 0,55 1,55 ± 0,25 - ‘Статистически значимо по отношению к контролю, тест Манна-Уитни (p < 0,05). Разработанная методика была валидирована по показателям воспроизводимости и точности. Воспроизводимость метода. Контроль воспроизводимости методики проводили путем многократного тестирования препарата сравнения алагебриума. В разные дни проводили по 3-5 измерений одной и той же субмаксимальной концентрации препарата (5 мМ). Полученные результаты были близкими (коэффициент вариации ± 1,05 %). Точность метода. Внутрилабораторный разброс данных вреднее ± 3SD) для субмаксимальной концентрации алагебриума, протестированной в разные дни, составил 46,02 % ± 3*0,48 % = 44,58 - 47,46. В результате 95,33 % измеренных величин находятся в пределах среднего ± 3SD. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, в результате проведенного исследования была настроена методика для изучения регликирующей активности соединений in vitro и доказана ее релевантность. Определена оптимальная доза для тестирования соединений с предполагаемой регликирующей активностью, которая составила 5 мМ. На данной модели было подтверждено отсутствие реглики-рующих свойств у ингибитора образования КПГ аминогуанидина. Данная воспроизведенная модель является адекватной и в дальнейшем может служить для оценки регликирующей активности соединений.

About the authors

A. A. Spasov

Volgograd State Medical University; Volgograd Medical Research Centre

A. I. Rashchenko

Volgograd State Medical University; Research Centre of Pharmacology

A. A. Brigadirova

Volgograd State Medical University; Volgograd Medical Research Centre

Email: a.brigadirova@gmail.com

References

Supplementary files