A SIMPLE METHOD OF SEARCHING FOR COMPOUNDS WITH GABAв-MIMETICACTION

Abstract

The paper proposes a new method of searching for substances with GABAb-mimetic action using the isolated uterus horn. We studied the effect of baclofen on changing extracellular concentration of K+ and Ca2+ in a variety of physiological solutions.

Full Text

Метаботропные ГАМКв-рецепторы широко представлены в центральной нервной системе и в периферических автономных терминалях, а также в предсердиях, сосудах, кишечнике, миометрии. Это трансмембранные рецепторы, которые связаны через G-белки с калиевыми каналами [6]. Их активация вызывает ингибирование аденилатциклазной активности со снижением Ca2+ и повышением К+ проводимости в нейрональной мембране. Кроме того, данные рецепторы прямо связаны посредством G-белка с потенциалзависимыми кальциевыми каналами N- и P/Q-типов, которые вовлечены в процесс синаптического высвобождения нейромедиаторов [1, 5]. Иммунологические исследования показали наличие ГАМКв-рецепторов в желудочно-кишечном тракте (преимущественно в нейронах слизистой и мышечной оболочек кишечника, слизистой желудка) [4], при этом был выявлено уменьшение их количества по мере движения от верхних отделов ЖКТ к нижним [7]. Установлено, что агонист ГАМКв-рецепторов 3-амино-2-флу-оропропил фосфиновая кислота предупреждает расслабление нижнего пищеводного сфинктера, что перспективно для лечения гастроэзофагеальной рефлюксной болезни [1]. Доказано присутствие ГАМКв-рецепторных комплексов на миометрии, предоставляет возможность использования данного объекта для выявления соединений с ГАМКв-ергическим действием [3]. Выявлено ингибирующее действие агонистов ГАМКв-рецепторов на сократительную активность изолированной матки [2, 8]. Утеролитическая активность агонистов ГАМКв-рецепто-ров делает перспективным поиск препаратов, применяемых при угрозе невынашивания беременности. Спазмолитическую активность веществ определяют в исследованиях in vitro, используя различные методики, в том числе метод изолированных органов и тканей, регистрируя изменения механической активности органа или электрических потенциалов. Объектами исследования могут выступать крупные сосуды, кишечник и др. Наличие ГАМКв-рецепторов в миометрии делает возможным скрининг веществ со спазмолитическим действием при его использовании. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Создание простой методики поиска веществ с ГАМКв-миметическим действием с использованием изолированного рога матки крыс. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ При проведении исследования использовались следующие анализаторы: агонист ГАМКв-рецепторов баклофен «Sigma», блокатор калиевых каналов толбу-тамид «Sigma», блокатор кальциевых каналов нитрен-дипин «Sigma». Исследование выполнено на рогах матки, полученных от половозрелых самок крыс линии Вистар массой 200-250 г в стадии диэструса. Животные перед экспериментом содержались в условиях вивария при естественном освещении на стандартной диете без ограничения доступа к воде и пище. Эксперименты проводили в соответствиями с принципами биоэтики, правилами лабораторной практики (GLP), в соответствии с этическими нормами, изложенными в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1988), Приказом МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 «Об утверждении Выпуск 1 (57). 2016 39 ЩЩпрй [ЩшкПГМЩ правил лабораторной практики» и Приказом МЗ СССР № 755 от 12.08.1977. Животных наркотизировали раствором хлоралгидрата (интраперитонеально 400 мг/кг) и извлекали отрезок рога матки длиной 15-20 мм. Тщательно очищенный от соединительной ткани рог за 45 минут до начала эксперимента фиксировали в ванночке для изолированных органов, заполненной буферным раствором Кребса [118 ммоль/л NaCl, 4,7 ммоль/л KCl, 1,64 ммоль/л MgSO4, 2,5 ммоль/л CaCl2, 25 ммоль/л NaHCO3, 1,25 ммоль/л NaH2PO4, 5,55 ммоль/л гдюкозы (pH 7,4)], с постоянной аэрацией и термостатированием при 27 °С. Помимо этого использовались: гипокальциевый раствор Тироде [136,9 ммоль/л NaCl, 2,68 ммоль/л KCl, 0,9 ммоль/л CaCl2, 1,05 ммоль/л MgSO4, 11,9 ммоль/л NaHCO3, 0,42 ммоль/л NaH2PO4, 5,55 ммоль/л глюкозы (pH 7,4)]; раствор де Жалона [154 ммоль/л NaCl, 5,63 ммоль/л KCl, 0,55 ммоль/л CaCl2, 5,95 ммоль/л NaHCO3, 2,775 ммоль/л глюкозы (pH 7,4)]. В течение периода адаптации и последующего эксперимента буфер в ванночке меняли каждые 15 мин. Спонтанные и навязанные электрической стимуляцией сокращения рога матки регистрировали с помощью комплексной установки для изолированных органов: ванночка («Ugo Basile», Италия), изотонический датчик и самописец («Unirecord Ugo Basile», Италия); pH-метр («Измерительная техника», Россия). рН растворов в каждом эксперименте равнялась 7,4. Воздействие током на изолированный рог матки изучали в растворе Кребса, амплитуда составляла 50 В с частотой 0,25 Г ц, длительность воздействия 10 с, повторный ток давали через 3 минуты после исходного. Между каждым введением вещества препарат изолированного рога отмывался не менее 15-20 мин. Сокращения регистрировали с помощью изотонического датчика и самописца при изотонической нагрузке в 0,5 г. Об уровне ГАМКв-активности судили по изменению сократительной активности рога матки при введении агониста ГАМКв-рецепторов баклофена в концентрациях 10-7-10-3 моль/л по сравнению с изначальным уровнем спонтанных сокращений (Д %). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ После ввода баклофена в различных концентрациях наблюдалось снижение средней амплитуды спонтанных сокращений (h) в 93 % случаев. В 7 % случаев изменений не отмечалось. При введении баклофена в концентрации 107 моль/л в большинстве случаев (75 %) снижение средней амплитуды спонтанных сокращений составляло до 30 % относительно исходного уровня и в среднем составило 16,6 %. При введении баклофена в концентрации 10-5 моль/л в 39 % случаев снижение средней амплитуды составило свыше 30 % и в 50 % случаев до 30 % относительно исходного уровня. Амплитуда спонтанных сокращений уменьшилась в среднем на 21 %. При введении баклофена в концентрации 10-3 моль/л в 57 % случаев наблюдалось снижение средней амплитуды спонтанных сокращений свыше 30 % относительно исходного уровня, при этом в 14 % случаев - свыше 50 % (среднее значение - 33,6%). В 82,5 % случаев наблюдалось снижение средней продолжительности сокращения (b) после ввода баклофена, при этом в 7,5 % случаев изменений не наблюдалось, а в 10 % - средняя продолжительность сокращения увеличилась. При введении баклофена в концентрации 10-7 моль/л снижение средней продолжительности сокращения в 83 % случаев составило до 30 %, в концентрации 10-5 моль/л снижение свыше 30 % наблюдалось уже в 50 % случаев, а в концентрации 10-3 моль/л - в 67 % случаев. Если сравнивать средние площади пиков (S) исходных спонтанных сокращений и после введения баклофена, то в 97,5 % случаев выявлено уменьшение. При введении баклофена в концентрации 10-7 моль/л уменьшение средней площади пика составило в среднем 30,2 %, при концентрации 10-5 моль/л - 38,1 %, при концентрации 10-3 моль/л - 48,9 %. Увеличение количества спонтанных сокращений (n) после ввода баклофена наблюдалось в 80 % случаев (32 из 40), не изменялось в 17,5 % (7 из 40), в 1 случае снизилось на 1. В концентрации 10-3 моль/л прирост количества сокращений составил в среднем 16,3 %, в концентрации 10-5 моль/л - 25,4 %, в концентрации 10-7 моль/л - 30,2 %. Следовательно, выявлен положительный хронотропный эффект, который обратно пропорционален концентрации баклофена. Отрицательный инотропный эффект баклофена обусловлен активацией пресинаптических ГАМКв-рецеп-торов, связанных с потенциалзависимыми кальциевыми каналами, что приводит к уменьшению высвобождения нейротрансмиттеров и снижению поступления ионов Са2+ в клетку, а также открытию постсинаптичес-ких калиевых каналов, повышением выхода ионов К+ из клетки и гиперполяризации мембраны. Далее исследовалось влияние баклофена в условиях меняющейся внеклеточной концентрации ионов калия и кальция на спонтанное мышечное сокращение в различных физиологических растворах. Изменения средней амплитуды спонтанных сокращений (h), средней продолжительности сокращений (b) и средней площади пика (S) в процентном соотношении при введении баклофена в различных концентрациях в трех физиологических растворах представлены в табл. В растворе с максимальным содержанием ионов Са2+ (раствор Кребса) среднее количество спонтанных сокращений за фиксированный промежуток времени составило 6,4, а прирост после ввода баклофена - 16 %, что можно связать с повышением возбудимости мембраны и сократительной активности при увеличении концентрации внеклеточного кальция. ГАМКв-миметическое действие баклофена приводит к снижению поступления ионов Са2+ в клетку. Следует отметить наибольший 40 Выпуск 1 (57). 2016 Изменения показателей спонтанных сокращений при вводе баклофена в различных физиологических растворах Раствор Концентрация 10-3 Концентрация 10-5 Концентрация 10'' % h % b % S % h % b % S % h % b % S Жалона -11 -33 -34 -20,9 -24 -38,4 -9,2 -20,5 -19,9 Кребса -62,4 -3,9 -65,5 -18,3 -8,2 -32,6 -22,9 -19,5 -38,8 Тироде -72 -11,4 -76,2 -27,6 -20,1 -43,6 -15,2 -21,5 -28,6 отрицательный инотропный эффект баклофена в концентрации 10-7 моль/л по сравнению с другими растворами. При введении блокатора кальциевых каналов L-типа (нитрендипин) в концентрации 10-7 моль/л в растворе Кребса отмечалось снижение силы спонтанных сокращений (в среднем на 7 %), продолжительности сокращений (в среднем на 4 %) и средней площади пика (в среднем на 12 %). Количество спонтанных сокращений практически не изменилось. Эффект баклофена был менее выражен по сравнению с исходным: наблюдалось уменьшение количества сокращений, инотропное действие практически не изменилось. В растворе Тироде со средним содержанием ионов К+ и Са2+ наблюдалось наибольшее количество исходных спонтанных сокращений (в среднем 9,7), их средний прирост после ввода баклофена составил 30 %. Отрицательный инотропный эффект баклофена был наибольшим в концентрациях 10-3 и 10-5 моль/л. Это вероятно связано с достаточным содержанием ионов Са2+ для развития сокращения, а при данной концентрации ионов К+ мембранный потенциал приближается к критическому уровню деполяризации, в результате повышается возбудимость мембраны клеток. В растворе де Жалона (максимальная концентрация ионов К+ и минимальная концентрация ионов Са2+) было выявлено наименьшее количество спонтанно возникающих сокращений (4,8), что связано с медленным выходом ионов К+ из клетки и удлинением фазы реполяризации. При снижении концентрации внеклеточного кальция происходит истощение его запасов в саркоп-лазматическом ретикулуме, что ведет к уменьшению силы сокращений. Отрицательное инотропное влияние баклофена на спонтанные сокращения было выражено в меньшей степени по сравнению с другими растворами, но наблюдался положительный хронотропный эффект (прирост среднего количества сокращений составил 27 %). Для изучения роли калиевых каналов в действии баклофена на миометрий были выполнены исследования с введением блокатора калиевых каналов (толбута-мид). В концентрации 10-7 моль/л в растворе де Жало-на наблюдались следующие изменения: уменьшение количества спонтанных сокращений (в среднем на 14 %), силы сокращений (в среднем на 9 %), увеличение продолжительности сокращения (в среднем на 11 %), незначительное снижение средней площади пика (в среднем на 2 %). Эффект связан с накоплением ионов К+ внутри клетки, уменьшением мембранного потенци ала, удлинением фазы реполяризации и снижением возбудимости. При сравнении эффекта баклофена после ввода блокатора калиевых каналов изначально в концентрации 10-7 моль/л было выявлено большее снижение силы сокращений (в среднем на 17 %, исходно - 14 %), но меньшее снижение продолжительности сокращения (в среднем на 9 %, исходно - 19 %). Прирост количества спонтанных сокращений составил в среднем 10,8 % (исходно - 33,7 %). Можно сделать вывод, что ответ на введение агониста ГАМКв-рецепторов баклофена зависит от ионного состава физиологического раствора и работы ионных каналов, при этом при увеличении концентрации ионов Са2+ усиливается инотропный, а при увеличении концентрации ионов К+-хронотропный эффект. При введении блокатора кальциевых каналов эффект баклофена снижается, что согласуется с его механизмом действия. При введении блокатора калиевых каналов инотропный эффект усиливается из-за накопления внутриклеточного калия, но снижается хронотропный эффект баклофена. Далее было проведено изучение влияния баклофена на сокращения, вызванные электростимуляцией. Регистрировали изначальные амплитуды навязанных электрической стимуляцией сокращений (исходное и повторное) в растворе Кребса, затем вводили баклофен в концентрации 10-7 моль/л и через 5 минут экспозиции воздействовали током. При сравнении величин навязанных сокращений было выявлено снижение амплитуды сокращения после ввода баклофена в концентрации 10-7 моль/л в среднем на 17 %. Также сравнивались величины исходного и повторного сокращения, выявилось следующее: - снижение амплитуды повторного сокращения по сравнению с исходным составило в среднем 18 %, после ввода баклофена - 13 %; - снижение длительности сокращений составило 25 %, после ввода баклофена - 12 %; - площадь под кривой сокращения уменьшилась в исходе на 39 %, после ввода баклофена - на 22 %. Следовательно, разница между двумя сокращениями (исходным и повторным) при вводе баклофена была менее выражена. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 1. Изолированный рог матки можно использовать в качестве объекта для скрининга веществ с ГАМКв- Выпуск 1 (57). 2016 41 ЩЩпрй [ЩшкПГМЩ миметическим действием, оценивая влияния на амплитуду и количество спонтанных, а также навязанных электростимуляцией сокращений. 2. Выявлен дозозависимый эффект при введении агониста ГАМКв-рецепторов баклофена (с увеличением концентрации нарастает отрицательный инотропный эффект). 3. Солевой состав раствора, в котором находится изолированный орган, также оказывает влияние на ответ при введении баклофена. При этом наибольший инотропный эффект в концентрации 10-7 моль/л наблюдается в растворе Кребса с максимальным содержанием ионов Ca2+, а хронотропный - в растворе де Жа-лона (максимальная концентрация ионов К+). В растворе Тироде со средними концентрациями ионов К+ и Са2+ ино- и хронотропный эффекты были наиболее выражены в концентрациях 10-3 и 10-5 моль/л. 4. Блокада ионных каналов также оказывает влияние на действие баклофена, при этом усиление инотроп-ного (но снижение хронотропного) эффекта наблюдается при блокаде калиевых каналов, а при блокаде кальциевых каналов - общее снижение действия баклофена.