THE INFLUENCE OF NOVEL GPR119 RECEPTOR AGONIST ZB-16 ON HEMOSTASIS IN DIABETIC RATS

Full Text

Численность больных сахарным диабетом (СД) типа 2 в мире за последние 10 лет увеличилась более чем в 2 раза и в настоящее время достигла 415 млн человек, включая около 193 млн недиагностированных случаев. Согласно прогнозам Международной диабетической федерации к 2040 году сахарным диабетом будет страдать 642 млн человек [10]. Ведущей причиной смертности и инвалидизации при СД типа 2 являются его сердечно-сосудистые осложнения. Основными причинами которых являются инсулинорезистентность, эндотелиальная дисфункция, гипертриглицеридемия, оксидативный стресс, атеросклероз и нарушения в системе гемостаза, формирующие протромботическое состояние крови. Нарушения в системе коагуляционного гемостаза и фибринолиза при СД типа 2 заключаются в повышении активности тромбина и факторов VIII/vWf, VII и X, увеличении концентрация фибриногена, приводящем к укорочению времени тромбообразования; повышении уровня ингибитора активатора плазминогена 1 (PAI-1), который замедляет процесс фибринолиза. По мере прогрессирования заболевания нарушения в системах коагуляции и фибринолиза способствуют развитию макро- и микрососудистых осложнений у пациента (инфаркт миокарда, инсульт, ретино-, нефро-, нейропатии и др.) [2, 3, 5]. В качестве базовой терапии СД типа 2, наряду с бигуанидами и производными сульфонилмочевины, все чаще используются средства, влияющие на систему инкретинов: ингибиторы ДПП-4 (Ситаглиптин, Вилдаг-липтин, Саксаглиптин, Линаглиптин, Алоглиптин, Лик-сисенатид и Госоглиптин) и синтетические аналоги ГПП-1 (Эксенатид, Лираглютид, Ликсисенатид и не зарегистрированные в РФ Эксенатид LAR, Дулаглутид, Альбиглютид и Таспоглютид) [1, 9]. Интерес к данной группе противодиабетических препаратов не случаен, помимо высокой эффективности и безопасности, они обладают рядом плейотропных эффектов в отношении сердечно-сосудистой системы: замедление атеросклеротического процесса, снижение апоптоза эндоте-лиоцитов и кардиомиоцитов [6, 9]. Основой для плей-отропного действия инкретиномиметиков является физиологическая способность ГПП-1 снижать уровень экспрессии некоторых молекул адгезии (VCAM-1 и ICAM-1) и провоспалительных цитокинов (MCP-1 и ФНО-а), снижать уровень PAI-1 [6, 9]. Отмечено, что физиологическая секреция ГПП-1 при СД типа 2 снижается, в то время как чувствительность к нему сохраняется. Напротив, секреция ГИП остается неизменной, но чувствительность к нему резко снижена. До недавнего времени, фармакологический подход, заключающийся в стимуляции секреции соб 48 == Выпуск 1 (57). 2016 ственных инкретинов еще не был реализован. С открытием ряда рецепторов, локализованных в первую очередь на энтероэндокринных клетках (GPR40, GPR41, GPR43, GPR119, GPR120 и др.), оказалась возможной фармакологическая регуляция секреции эндогенных инкретинов. В настоящее время агонист GPR40 (фа-сиглифам) находится на 3-й фазе клинических исследований, из агонистов GPR119 3 находятся на 2-й и 2 агониста на 1-й фазах клинических исследований [7, 8, 12]. Что говорит о стимуляции секреции эндогенных инкретинов как о признанном фармакологическим подходе в лечении СД типа 2. Тем не менее, на настоящий момент проведено недостаточно исследований по изучению влияния средств, стимулирующих секрецию инкретинов, на состояние гемостаза у животных с СД. Тогда как известно, что нормализация гликемии и основных параметров гемостаза при проведении противодиабе-тической терапии может свидетельствовать не только о компенсации углеводного обмена, но и о снижении риска развития макро- и микрососудистых осложнений у пациента. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Изучение влияние нового агониста GPR119 рецептора - соединения ZB-16 - на плазменный (коагуляционный) компонент гемостаза у животных с экспериментальным сахарным диабетом. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Субстанция соединения ZB-16 синтезирована ЗАО «Исследовательский Институт Химического Разнообразия» (г. Химки, Россия) и представляет собой высокоактивный (IC50 = 7 н1^) селективный агонист рецептора GPR119. Исследование выполнено на 50 половозрелых крысах-самках (возраст 6 мес., масса 240-260 г), с экспериментальным сахарным диабетом (ЭСД) типа 2. ЭСД моделировали однократным внутрибрюшинным введением стрептозотоцина (Sigma-Aldrich, США) 65 мг/кг на фоне предварительного (за 15 минут) введения никоти-намида (Sigma-Aldrich, США) 230 мг/кг [4]. После определения уровня гликемии (спустя 72 часа) были сформированы 4 экспериментальные группы (n = 10) из животных с уровнем глюкозы натощак 8-14 ммоль/л. Параллельно формировалась группа из 10 интактных животных того же возраста, веса и пола. Уровень глюкозы определялся в крови глюкометром Контур ТС (Bayer, Германия). Исследуемое соединение изучалось в двух эффективных дозах (0,1 и 1 мг/кг), отобранных по результатам предыдущих исследований. В качестве препарата сравнения использовали ингибитор ДПП-4 ситаг-липтин («Янувия», «Мерк Шарп и Доум Б.В.», Германия) как наиболее близкий по механизму действия в дозе 10 мг/кг, подобранной в соответствии с данными литературы [11]. Субстанцию соединения ZB-16 водили в течение 28 дней один раз в сутки, внутрижелудочно через зонд в виде суспензии, дисперсионной средой служила вода очищенная (объем введенной жидкости на одно животное составлял 0,1 мл на 100 г живой массы). Препарат сравнения и воду вводили в эквивалентном объеме. На 7-й, 14-й, 21-й и 28-й дни после начала лечения у животных оценивался тощаковый уровень глюкозы, затем проводили забор крови для определения параметров коагуляционного гемостаза. Изучение коагуляционного звена гемостаза. Определение показателей гемостаза осуществлялось на программируемом оптико-механическом коагулометре «Минилаб 701» с использованием наборов (НПО РЕНАМ, Россия) для определения активированного частичного тромбопластинового (АЧТВ), протромбинового (ПВ) и тромбинового времени (ТВ), а также концентрацию фибриногена в крови. Забор крови у животных производили из брюшной аорты. Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием Prism 5 (GraphPad Software Inc., США). Для проверки нормальности распределения использовали критерий Шапиро-Уилка. В зависимости от типа распределения использовали непараметрические (критерии Краскела-Уоллиса, Ньюме-на-Кейлса) и параметрические методы статистического анализа (критерий Стьюдента с поправкой Бонферро-ни). Значения p < 0,05 расценивались как статистически значимые. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Уровень тощаковой гликемии до лечения не отличался у животных всех экспериментальных групп и составлял от 8 до 14 ммоль/л. Введение исследуемого соединения в дозе 1 мг/кг в течение 4 недель животным с ЭСД способствовало снижению уровня глюкозы в крови до уровня сопоставимого с таковым у получавших ситаглиптин. Наиболее выраженный сахароснижающий эффект исследуемое соединение ZB-16 оказывало в дозе 1 мг/кг (табл.). В плазменном (коагуляционном) механизме свертывания крови, итогом которого является образование фибрина, основная роль принадлежит плазменным факторам (фибриноген, протромбин и др.). Первая фаза плазменного гемостаза - образование протромбиназы. Показателем, характеризующим первую фазу плазменного гемостаза, является активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ) [3, 5]. По результатам проведенного исследования в группе животных с ЭСД наблюдается достоверное (p < 0,05) снижение АЧТВ на 38 % по отношению к группе интактных животных, что свидетельствует о нарушениях в системе внутреннего каскада свертывания плазмы (рис. А). Выпуск 1 (57). 2016 49 ЩЩпрй [ЩшкПГМЩ Уровень гликемии у животных с сахарным диабетом, получавших лечение в течение 4 недель, ммоль/л и отклонение от уровня гликемии до лечения (%) Группа/время наблюдения Время после начала лечения, сут 0 7 14 21 28 Интакт 4,1 ± 0,1 (0) 4,4 ± 0,2 (7) 4,2 ± 0,3 (2) 4,1 ± 0,1 (0) 3,7 ± 0,2 (-10) ЭСД 13,6 ± 1,0* (0) 10,9 ± 0,7 (-20) 10,5 ± 0,7 (-23) 9,8 ± 0,8 (-28) 9,6 ± 0,5 (-29) ZB-16 0,1, мг/кг 13,1 ± 0,9 (0) 10,8 ± 0,7 (-18) 9,9 ± 0,7 (-24) 9,0 ± 0,5 (-31) 8,4 ± 0,5# (-36) ZB-16 1, мг/кг 13,4 ± 0,6 0 10,4 ± 0,9 (-22) 9,4 ± 0,7 (-30) 8,4 ± 0,5# (-37) 7,9 ± 0,4 (-41) Ситаглиптин 12,8 ± 0,6 (0) 10,1 ± 0,6 (-21) 9,2 ± 0,5 (-28) 8,1 ± 0,4 (-37) 7,5 ± 0,5# (-41) Примечание. ЭСД - группа животных с экспериментальным пред-диабетом без лечения. ‘Достоверно по отношению к группе интактных животных (p < 0,05); ^достоверно по отношению к группе ЭСД (p < 0,05). Вторая фаза плазменного гемостаза-тромбино-образование. В эту фазу протромбиназа вместе с факторами коагуляции V, VII, X и IV переводит неактивный протромбин в активную форму - тромбин. Показателем, характеризующим вторую фазу, является протром-биновое время (ПВ) [3, 5]. У группы животных с ЭСД по сравнению с группой интактных отмечается достоверное (p < 0,05) снижение протромбинового времени на 40 %, что свидетельствует 0 снижении антикоагуляционного потенциала. Исследуемое соединение повышало значения ПВ на 44 % (в дозе 0,1 мг/кг) (p < 0,05), на 55 % (в дозе 1 мг/кг) (p < 0,05) соответственно, по отношению к группе животных с ЭСД без лечения (рис. Б.). Препарат сравнения уступал по выраженности действия исследуемому соединению в дозе 1 мг/кг (рис. Б). Третья фаза-фибринообразование. Показателем, характеризующим третью фазу, является тромбиновое время и концентрация фибриногена в плазме [3, 5]. Тромбиновое время характеризует конечный этап процесса свертывания - превращение фибриногена в фибрин под действием тромбина. В условиях сахарного диабета и развивающейся на его фоне эндотелиальной дисфункции наблюдается достоверное (p < 0,05) укорочение тромбинового времени (ТВ) у животных с ЭСД без фармакологической поддержки на 25,4 %, по сравнению с интактными, что также свидетельствует об усилении прокоагуляционных сдвигов в системе гемостаза. Под влиянием исследуемого соединения (в равной степени при использовании его в дозе 0,1 и1 мг/кг) происходит достоверное удлинение ТВ (рис. В). В группе животных с ЭСД наблюдалось достоверное увеличение уровня фибриногена в плазме крови на 124,9 % (p < 0,05) по сравнению с группой интактных животных, что подтверждает наличие нарушений в системе плазменного гемостаза (повышение образования сгустка фибрина на последней стадии свертывания кро ЭСД - группа животных с экспериментальным сахарным диабетом без лечения; Интакт - интактная группа животных. *Различия статистически значимы по отношению к группе интактных животных (p < 0,05); #различия статистически значимы по отношению к группе животных с ЭСД (p < 0,05). Рис. Основные показатели гемостаза у животных с сахарным диабетом после 4-недельного введения исследуемого соединения и ситаглиптина. А - АЧТВ; Б - протромбиновое время; В - тромбиновое время; Г - уровень фибриногена В группе животных, получавших исследуемое соединение и препарат сравнения (ситаглиптин), наблюдалось удлинение АЧТВ, так, при применении ZB-16 в дозе 1 мг/кг на 31,8 % (p < 0,05), в дозе 0,1 мг/кг на 18 %, ситаглиптина на 12,8 % соответственно, по отношению к группе животных с ЭСД без лечения. Таким образом, наиболее выраженное действие на данный показатель наблюдалось у ZB-16 в дозе 1 мг/кг. 50 Выпуск 1 (57). 2016 ви) (рис. Г). Концентрация фибриногена является одним из показателей, характеризующих третью фазу образования тромба - фибринообразование. Кроме того, фибриноген является одним из белков «острой фазы», концентрация которых повышается при нарушениях системы гемостаза и острых воспалениях. У группы животных с ЭСД, получавшей в качестве лечения субстанцию соединения ZB-16 в дозах 0,1 и 1 мг/кг, концентрация фибриногена составила (3,5 ± 0,7) и (3,4 ± 0,7) г/л (p < 0,05) соответственно, что было достоверно меньше (на 36,8 и 38,3%), чем в группе животных с ЭСД без лечения. Препарат сравнения оказывал менее выраженный эффект (рис. Г). Таким образом, представленные данные свидетельствуют о нормализации показателей гемостаза у животных с СД типа 2, получавших в течение 4 недель соединение ZB-16 и ситаглиптин. Достижение нормогликемии в клинике приводит к реальному улучшению состояния гемостаза, однако это не обеспечивает полного восстановления его нарушений, возникающих с формированием инсулинорези-стентности [3]. Некоторые существующие гипоглике-мические препараты оказывают влияние на систему гемостаза, посредством устранения инсулинорезистен-тности (бигуаниды и тиазолидиндионы) [3]. Средства, влияющие на систему инкретинов, способны влиять на гемостаз посредством улучшения функционирования эндотелиоцитов. ГПП-1 снижает экспрессию эндотелиоцитами адгезивных белков (VCAM-1 и ICAM-1) и хемоаттрактантов (MCP-1 и ФНО-а), которые отвечают за активацию и накопление иммунных клеток в сосудистой стенке [6, 9], что является одним из ключевых процессов при атеросклерозе и приводит к усилению прокоагуляционных сдвигов в системе гемостаза и воспалению. Также ГПП-1 снижает экспрессию, повышенного при СД типа 2, PAI-1, который замедляет процесс фибринолиза, что непосредственно ухудшает баланс в системе гемостаза [3, 6, 9]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В проведенном исследовании установлено, что гипергликемия, связанная с экспериментальным сахарным диабетом приводит к выраженным нарушениям в системе гемостаза. Введение агониста GPR119 и ингибитора ДПП-4 приводило к нормализация оцениваемых параметров (АЧТВ, ПВ, ТВ и уровень фибриногена). По всей видимости, это связано не только с их сахароснижающим эффектом и способностью улучшать постпран-диальный контроль гликемии, а также с эндотелиопо-зитивным эффектом и способностью понижать уровень PAI-1. Нормализация ключевых показателей системы гемостаза безусловно является важным качеством, которое необходимо учитывать при выборе или разработке гипогликемического средства.

About the authors

D. V. Kurkin

Volgograd State Medical University, Department for Pharmacology and Biopharmacy

Email: strannik986@mail.ru

E. V. Volotova

Volgograd State Medical University, Department for Pharmacology and Biopharmacy

D. A. Bakulin

Volgograd State Medical University, Department for Pharmacology and Biopharmacy

M. A. Chafeev

Chemical Diversity Research Institute

I. N. Tyurenkov

Volgograd State Medical University, Department for Pharmacology and Biopharmacy

References

Supplementary files