EFFECT OF GOLD NANOPARTICLES ON THE VIABILITY AND METABOLIC PARAMETERS OF CELL LINES OVER TIME

Full Text

Gold nanoparticles, cytotoxicity, lactate dehydrogenase, acid phosphatase, recover. Наночастицы золота (НЧЗ) имеют ряд физических свойств, которые делают их привлекательными для использования в диагностических и терапевтических целях. Так, ослабление рентгеновских лучей с помощью наночастиц золота привело к их использованию в компьютерной томографии и в качестве адъювантов для лучевой терапии [4]. Кроме того, НЧЗ обладают потенциалом для их применения в таких областях биомедицины, как адресная доставка лекарственных средств, генная терапия, иммобилизация ферментов, создание диагностикумов, биодатчиков и биочипов [3, 4, 6]. Однако, несмотря на то, что ядро наночастиц золота считается инертным и биосовместимым, мы все еще далеки от прогнозирования того, какой эффект оказывают наночастицы золота на биологические системы. Использование клеточных культур при изучении данной проблемы позволяет в относительно короткие сроки получить предварительную информацию о специфическом действии тестируемых наночастиц. В то же время такие краткосрочные эксперименты (4-24 часа) зачастую не являются достаточными для обнаружения отдаленных последствий, которые могут повлиять на основные биологические параметры клеток. Также упускается из виду и вопрос об обратимости нарушений клеточных функций после удаления инородного компонента (в данном случае, наночастиц). Кроме того, основное направление большинства исследований сводится к выявлению неблагоприятного воздействия НЧЗ на биообъекты, но при этом не учитываются адаптационные механизмы как организма в целом, так и клетки, позволяющие им приспосабливаться к возмущениям гомеостаза. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Изучение ответной реакции нескольких клеточных линий на коллоидное золото 5 нм в различные сроки экспозиции, включая восстановительный период. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Наночастицы золота. Наночастицы золота (НЧЗ) диаметром 5 нм были получены методом восстановления золотохлористоводородной кислоты одновременно натриевой солью ЭДТА и борогидридом натрия в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (г. Саратов) [1]. Концентрация 5 нм частиц золота составила 7 х 1013 в 1 мл [7]. Определение размеров наночастиц и их концентрация проводилась с помощью анализатора размера частиц «ZetaSizer» и электронного трансмиссионного микроскопа «Libra-120». Культуры клеток. Исследование проводилось на 4 монослойных клеточных линиях: HuH, Vero, 3T3 и A549, Выпуск 3 (59). 2016 17 ЩШгорСз [ЩсмеТКЩ которые были любезно предоставлены Институтом Белка РАН (г. Пущино). Клетки Vero и 3T3 культивировались на среде DMEM/F12 (ПанЭко), а HuH и A549 на среде Игла с добавлением 10%-й эмбриональной сыворотки («РАА», ПанЭко), а также глутамина и пенициллин-стрептомицина (ПанЭко). Культуральные флаконы (75 см3) с клетками инкубировали в ^^инкубаторе при концентрации CO2 5%-й, температуре 37 оС и относительной влажности не менее 90 %. К моменту, когда конфлюэнтность клеток приближалась к 90-95 %, их снимали со дна флакона и суспендировали в соответствующей питательной среде до достижения концентрации от 1-2 х 105 до 6-8 х 105 в зависимости от клеточной линии. Для постановки цитотоксических тестов 100 мкл клеточной суспензии рассевали в 96-луночные планшеты из расчета 4-6 х 104 клеток на лунку. Через 24 часа, в течение которых клетки подращивались и прикреплялись к дну лунок, проводили замену среды (100 мкл) и добавляли по 100 мкл НЧЗ исследуемых концентраций. Соотношение питательной среды к НЧЗ составляло 1:1 - максимально возможное разведение. Через 4, 24 и 48 часов после внесения НЧЗ отбирали аликвоты надосадочной жидкости и переносили в чистые планшеты для определения активности ферментов. Оставшиеся планшеты с клетками использовали для постановки цитотоксического теста. По истечении 48-часового периода инкубации клеточных линий с НЧЗ производили замену питательной среды, содержащей наночастицы, на чистую среду и культивировали еще 24 часа. Затем проводили аналогичные измерения активности ферментов и показатели жизнеспособности клеток. Все эксперименты с культурами клеток проводились в шестикратных повторах с отрицательными и положительными контролями. Определение лактатдегидрогеназы и кислой фосфатазы в культуральной среде. Изменения метаболического состояния клеток оценивали по следующим показателям: активность в среде инкубации цитозольного фермента лактатдегидрогеназы (ЛДГ), который использован как маркер целостности клеточной мембраны; активность в среде инкубации кислой фосфатазы (КФ) в качестве маркера активации лизосомаль-ного аппарата клеток. Для определения активности ЛДГ и КФ были использованы биохимические наборы фирмы ВИТАЛ, модифицированные для планшетного анализатора. Измерение активности ферментов проводили на многофункциональном планшетном фотометре SYNERGYHTX (BioTek) с использованием стандартов и калибровочных графиков. Активность ферментов рассчитывалась в Ед/мл инкубационной среды с помощью программsGEN5 (BioTek). LEVE/DEAD Тест. Использование классических цитотоксических тестов (МТТ-анализ и тест с Нейтральным красным) для тестирования наночастиц, по сообщениям ряда авторов, лимитировано их необычными физико-химическими свойствами. В первую очередь, это связано с их окислительно-восстановительным потенциалом (образование свободных радикалов и супероксидов), что может повлиять на точность результатов [7]. Поэтому в качестве современного альтернативного метода определения индекса цитотоксичности был использован флуоресцентный тест LEVE/DEAD (MolecularProbes). В состав набора входят 2 флуоресцентные метки: ацетоксиметиловый кальцеин (АМ) - маркер живых клеток и этидия го-модер (EtD) - индикатор мертвых или поврежденных клеток. Все манипуляции с клетками и постановка теста проводились согласно инструкции производителя. Для измерения флуоресценции был использован многофункциональный планшетный фотометр SYNERGYHTX (BioTek). Расчет процентного содержание живых (AM) и мертвых (EtD) клеток проводился с помощью программ sGEN5 (BioTek). Помимо расчетов, рекомендованных производителем, мы рассчитывали отношение АМ/EtD. По нашим данным, отношение количества живых клеток к мертвым оказалось наиболее информативным. Так, отношение АМ/ EtD = 1 свидетельствовало о том, что на 1 живую клетку приходилась 1 мертвая, то есть этот показатель соответствовал LC50 и коррелировал (с небольшими отклонениями) с результатами подсчета количества погибших клеток с использованием трипано-вого синего (данные не представлены). Статистический анализ. Для проведения статистического анализа использовались программы Microsoft Excel и STATISTIKA. Для биохимического исследования рассчитывались параметры среднего арифметического значения. Сравнения между контрольной и экспериментальными группами проводили с помощью непараметрического анализа с использованием критерия Манна-Уитни. Статистически достоверными считались результаты при р < 0,02. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исследование активности кислой фосфатазы в культуральной среде всех клеточных линий в первый срок инкубации их с наночастицами золота (4 часа) показало практически линейную зависимость в соотношении доза-эффект (табл. 1). Второй небольшой всплеск активности кислой фосфатазы наблюдали через 48 часов после добавления в инкубационную среду наночастиц золота в концентрациях 28,5 мкг/мл и 57 мкг/мл. Активность фермента через 24 часа после удаления НЧЗ в опытных группах не отличалась от контрольных значений. 18 Выпуск 3 (59). 2016 Исследование активности ЛДГ показало, что наибольшее влияние на проницаемость мембран клеток оказывало содержание 5 нм коллоидного золота в питательной среде в максимальной концентрации (57 мкг/мл). Так, клеточные линии 3Т3 и А549 демонстрировали повышенный уровень ЛДГ в среде вплоть до удаления НЧЗ. В то время как для культур клеток Vero и HuH этот эффект носил отсроченный характер и проявлялся через 24 часа после добавления НЧЗ. Следует отметить, что культивирование клеточной линии Vero в восстановительный период сопровождалось снижением активности ЛДГ в ростовой среде (табл. 2). Результаты флуоресцентного LIVE/DEAD теста показали, что наиболее чувствительной к воздействию на ночастиц золота в первые сроки эксперимента оказалась клеточная линия А549. В остальных случаях процент погибших клеток не превышал 10-15 даже в группах, содержащих наибольшую концентрацию частиц, а пролиферативная активность оставалась на уровне контрольных значений. Об этом же свидетельствовал и показатель АМ/EtD (рис., первый ряд). По истечении 48 часов совместной экспозиции НЧЗ с клеточными линиями всех типов было обнаружено значительное снижение процента живых клеток. При этом в отдельных эпизодах отношение АМ/ EtD было меньше двух условных единиц, что практически приравнивалось к значению LC50 (рис., второй ряд). Таблица 1 Активность КФ (мЕД/мл) в питательной среде в различные сроки экспозиции культур клеток с 5 нм коллоидным золотом Культура клеток/срок Концентрация НЧЗ Контроль 5,7 мкг/мл 11,4 мкг/мл 28,5 мкг/мл 57,0 мкг/мл 3T3/4h 0,035 ± 0,014 0,066 ± 0,035 0,087 ± 0,021 0,16 ± 0,018 0,261 ± 0,021 3T3/24h 0,205 ± 0,063 0,208 ± 0,063 0,257 ± 0,033 0,236 ± 0,078 0,330 ± 0,071 3T3/48h 0,306 ± 0,053 0,368 ± 0,091 0,379 ± 0,087 0,438 ± 0,116 0,635 ± 0,076 3T3/48+24h 0,691 ± 0,116 0,847 ± 0,069 0,931 ± 0,086 0,802 ± 0,052 0,795 ± 0,035 HuH/4h 0,059 ± 0,031 0,09 ± 0,008 0,097 ± 0,020 0,143 ± 0,013 0,233 ± 0,024 HuH/24h 0,281 ± 0,107 0,247 ± 0,048 0,271 ± 0,061 0,281 ± 0,035 0,382 ± 0,062 HuH/48h 0,323 ± 0,069 0,320 ± 0,036 0,271 ± 0,024 0,344 ± 0,052 0,472 ± 0,026 HuH/48+24h 0,330 ± 0,074 0,337 ± 0,04 0,334 ± 0,049 0,250 ± 0,065 0,375 ± 0,086 Vero/4h 0,035 ± 0,008 0,115 ± 0,031 0,153 ± 0,023 0,174 ± 0,024 0,282 ± 0,013 Vero/24h 0,302 ± 0,094 0,292 ± 0,036 0,445 ± 0,176 0,535 ± 0,449 0,511 ± 0,029 Vero/48h 0,496 ± 0,069 0,469 ± 0,024 0,511 ± 0,031 0,632 ± 0,054 0,841 ± 0,072 Vero/48+24h 0,882 ± 0,074 1,389 ± 0,625 1,129 ± 0,101 1,177 ± 0,236 0,99 ± 0,15 A549/4h 0,032 ± 0,007 0,059 ± 0,017 0,076 ± 0,014 0,118 ± 0,018 0,247 ± 0,04 A549/24h 0,083 ± 0,025 0,07 ± 0,025 0,104 ± 0,033 0,195 ± 0,025 0,271 ± 0,057 A549/48h 0,483 ± 0,021 0,577 ± 0,087 0,629 ± 0,15 0,688 ± 0,136 0,910 ± 0,14 A549/48+24h 0,379 ± 0,108 0,354 ± 0,043 0,375 ± 0,038 0,299 ± 0,008 0,368 ± 0,029 Таблица 2 Активность ЛДГ в надосадочной жидкости в различные сроки экспозиции культур клеток с 5 нм коллоидным золотом Культура клеток/срок Группа Контроль 5,7 мкг/мл 11,4 мкг/мл 28,5 мкг/мл 57,0 мкг/мл 3T3/4h 1,214 ± 0,810 1,821 ± 1,019 4,553 ± 2,322 8,5 ± 3,135 15,381 ± 4,72 3T3/24h 2,631 ± 1,382 2,226 ± 1,382 3,036 ± 0,775 4,25 ± 3,056 13,762 ± 2,383 3T3/48h 6,881 ± 5,550 8,297 ± 3,702 2,429 ± 1,749 5,262 ± 3,135 16,19 ± 2,383 3T3/48+24h 6,78 ± 6,74 9,107 ± 8,422 16,797 ± 11,067 10,119 ± 7,608 6,172 ± 5,961 HuH/4h 1,356 ± 0,734 1,72 ± 0,834 1,429 ± 1,238 6,678 ± 2,755 14,166 ± 1,045 HuH/24h 4,29 ± 4,050 16,797 ± 13,964 12,952 ± 6,476 20,035 ± 9,072 24,69 ± 1,927 HuH/48h 12,547 ± 10,668 6,375 ± 3,686 5,869 ± 2,675 9,512 ± 3,263 16,392 ± 1,382 HuH/48+24h 16,19 ± 3,797 9,714 ± 5,162 13,053 ± 12,534 10,119 ± 6,948 11,738 ± 5,781 Vero/4h 11,738 ± 4,650 7,286 ± 4,334 5,059 ± 4,737 6,881 ± 0,467 17,202 ± 1,532 Vero/24h 11,94 ± 7,576 13,154 ± 7,719 9,107 ± 4,737 19,226 ± 7,069 38,047 ± 11,275 Vero/48h 1,761 ± 1,534 13,154 ± 7,007 9,006 ± 7,213 12,547 ± 7,073 20,845 ± 3,263 Vero/48+24h 15,988 ± 7,775 15,988 ± 9,333 8,5 ± 3,402? 6,881 ± 2,765? 4,958 ± 3,656? A549/4h 1,821 ± 0,405 1,417 ± 1,214 3,036 ± 1,669 4,25 ± 3,394 15,583 ± 1,382 A549/24h 5,869 ± 3,263 5,262 ± 4,206 16,595 ± 16,424 9,714 ± 5,647 12,952 ± 1,145 A549/48h 1,72 ± 1,06 1,595 ± 0,908 3,167 ± 1,909 6,071 ± 2,037 13,154 ± 2,417 A549/48+24h 2,631 ± 1,382 3,643 ± 1,927 3,44 ± 2,417 6,476 ± 5,949 8,905 ± 7,959 Выпуск 3 (59). 2016 19 ШШґорСз [ЩсмеТКЩ Восстановительный период после удаления наночастиц характеризовался увеличением процентного содержания живых клеток. В то же время самый незначительный прирост наблюдался в тех группах клеток, которые культивировались с исходной концентрацией НЧЗ - 57 мкг/мл (рис., третий ряд). Сам факт проникновения НЧЗ в внутрь клетки с помощью фагоцитоза или через клатрин-опосредо-ванный механизм эндоцитоза давно описан в научной литературе и не подвергается сомнениям [5]. В нашем эксперименте значительное повышение активности кислой фосфатазы в первые сроки эксперимента свидетельствовало об интернализации НЧЗ во внутреннюю среду клеток и активации их лизосомального аппарата. Второй пик повышения активности кислой фосфатазы через 48 часов мог быть сопряжен с повторным рецик-лингом наночастиц из клетки в питательный раствор и обратно, в цитоплазму клеток. По результатам нашего исследования присутствие наночастиц золота в культуральной среде сопровождалось повреждением мембран клеток, в результате чего в надосадочной жидкости наблюдалось увеличение активности ЛДГ. При этом резистентность компонентов клеточной мембраны различных клеточных линий к воздействию наночастиц была вариативной. В то же время отмечался дозозависимый эффект: наибольший урон для клеток отмечался при их совместном культивировании с исходной концентрацией НЧЗ (57 мкг/мл), что может связано с их повышенной адсорбцией на поверхности клеток большого количества частиц из раствора. Результаты LIVE/DEADтеста, в свою очередь, продемонстрировали, что цитотоксический эффект зависел не столько от концентрации НЧЗ в культуральной среде, сколько от времени воздействия, то есть длительное нахождение наночастиц золота в ростовой среде оказывало прямое негативное воздействие на культуры клеток. При этом сопоставление биохимических и цитотоксических данных показало, что в большинстве случаев активность ЛДГ значительно превалировала над процентным соотношением погибших клеток (результаты не представлены). Такое расхождение могло быть обусловлено перестройкой энергетического обмена клетки и, как следствие, увеличением активности всего изоферментного спектра ЛДГ, свойственного для каждого вида клеточной линии. Косвенным образом это подтверждали результаты, полученные в восстановительный период, когда, несмотря на большое количество погибших клеток в популяции, уровень активности ЛДГ возвращался к исходным значениям, а иногда и снижался как в случае с культурой Vero. Наблюдаемые нами явления по своей сути являлись нормальной биологической реакцией живой системы в ответ на поступление инородного вещества. Результаты нашего эксперимента продемонстрировали, что удаление раздражающего фактора приводило к восстановлению функциональных свойства клеток. К аналогичным выводам пришла и группа ученых [5], которая показала, что скорость восстановления клеток после их совместной экспозиции с НЧЗ зависела от размера, концентрации и времени воздействия наночастиц. Поэтому, несмотря на то, что отдельные клетки в силу своей изолированности от целостного организма обладают ограниченным набором адаптивных реакцией, даже столь урезанные возможности помогают им приспосабливаться к воздействию наночастиц. 3Т3 СМ HuH Vero 100% 90% 80% 70% І К 5,7 11.4 3,8,5 57 Концентраций H4J. мкгтмл A549 5.7 11,4 28,5 57 Концентрация НЧ'З, мкг/мл СО О О. О т 'Мсм + со 'М- Рис. Графическое отображение данных цитотоксического теста LIVE/DEAD. В столбчатой диаграмме указано процентное содержание живых (АМ) и мертвых клеток (EtD), а на графике - отношение живых клеток к мертвым (АМ/EtD) выражено в условных единицах 20 Выпуск 3 (59). 2016 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, проведенное нами исследование показало, что негативное влияние наночастиц золота со средним диаметром 5 нм на клеточные системы носило обратимый характер. При этом наблюдаемые изменения были обусловлены, в большинстве случаев, включением адаптивных механизмов клеток, задействованных в компенсации повреждающего действия НЧЗ.

About the authors

Yu. I. Velikorodnaya

FederalStateUnitary Enterprise Research Institute of Hygiene, Toxicology and Occupational Pathology FMBA of Russia

Email: alta-u@mail.ru

A. Ya. Pocheptsov

FederalStateUnitary Enterprise Research Institute of Hygiene, Toxicology and Occupational Pathology FMBA of Russia

I. A. Dvoryashina

FederalStateUnitary Enterprise Research Institute of Hygiene, Toxicology and Occupational Pathology FMBA of Russia; Volgograd State Medical University

V. L. Zagrebin

Volgograd State Medical University

O. I. Sokolov

Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms Russian Academy of Sciences

References

Supplementary files