PATHOMORPHOLOGICAL AND MOLECULOBIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF GYNECOMASTIA

Abstract

В данной работе, на основании световой, электронной микроскопии и иммуногистохимического анализа, представлены патоморфологическая и молекулярно-биологическая характеристика различных форм гинекомастии.

Full Text

По определению ВОЗ ГМ считают дисгормональ-ный гиперпластический процесс, характеризующийся широким спектром пролиферативных и регрессивных изменений ткани молочной железы с ненормальным соотношением эпителиального и соединительно-тканного компонентов [3, 6, 13]. Патология молочных желез у мужчин встречается значительно реже, чем у женщин. Как и у женщин, патологию молочной (грудной) железы можно разделить на доброкачественную и злокачественную. Среди доброкачественных опухолей наиболее частой является гинекомастия (ГМ). Интерес специалистов к ГМ связан с тем, что данный процесс является фоновым для последующего возникновения и развития рака грудной железы, и частота развития рака молочной железы у лиц с ГМ в 3-5 раз выше, чем в популяции в целом. К этиологическим моментам возникновения ГМ относят: состояние затяжного стресса (неудовлетворенность семейным положением, бытовые конфликты, конфликтные ситуации на работе, неблагоприятные сексуальные факторы), изменения в эндокринной системе (гиперэстрогению, что часто связано с хронической печеночной недостаточностью вследствие алкоголизма). ГМ часто сопутствует различным физиологическим расстройствам в мужском организме. Наиболее распространенными факторами риска являются период полового созревания, возрастные тестикулярные расстройства, побочное действие лекарственных препа ратов [7, 9, 10, 12-15]. Вероятность развития идиопати-ческой ГМ возрастает с увеличением массы тела и толщины подкожного жирового слоя. ГМ может быть вызвана сопутствующими заболеваниями: пролактиномой гипофиза, синдромом полной и частичной нечувствительности к андрогенам, неврологическими нарушениями, ожирением, заболеваниями печени, тиротоксикозом, дефицитом 17-гидроксистероид-редуктазы, синдромом Кляйнфельте-ра, опухолями печени, надпочечников и яичек (клеток Сер-толи и Лейдига), диабетом, трисомией 4-й хромосомы [12]. ГМ может быть опосредована мутацией гена, кодирующего ароматазу, что приводит к повышенной активности этого фермента. Имеются также сведения о том, что ГМ передается по аутосомно-доминантному принципу. К ГМ приводят кастрация и функциональный препубертатный гипогонадизм. Она развивается также при лечении высокими дозами эстрадиола, антиэстрогенами, кетоконазо-лом, циклоспорином А, циметидином, метотрексатом, фе-нотиазанами, трициклическими антидепрессантами, антиандрогенами, спиронолактоном, нейролептическими средствами [4]. ГМ встречается у 21-34 % спортсменов, употребляющих стероидные анаболики, причем вероятность развития опухоли выше при хроническом употреблении больших доз анаболиков [14]. В клинике различают 2 формы ГМ: диффузную и узловую. Основываясь на этиологических факторах, выделяют 5 форм ГМ: 32 Выпуск 3 (59). 2016 - физиологическую (ювенильную, пубертатного и старческого возраста); - эндокринную (при гипогонадизме, гипотиреозе, опухолях яичка, надпочечников); - не эндокринную; - медикаментозную (при приеме эстрогенов, тестостерона, андрогенов и т.д.); - идиопатическую. По мнению различных авторов, патология развивается в пределах протоково-дольковой единицы. Участки фиброзной ткани сочетаются с кистозными полостями; кисты выстланы атрофическим, уплощенным эпителием, или эпителием, подвергшимся апокриновой метаплазии. В соответствии с морфологическими критериями выделяют пролиферативную и непролиферативную формы дисплазии. Считается, что степень риска развития рака молочной железы нарастает в зависимости от выраженности протоковой, дольковой или внутрикис-тозной пролиферации. По степени пролиферативной активности эпителия различают: - ГМ без пролиферации (риск развития рака увеличивается в 1,5 раза); - гинекомастию с пролиферацией эпителия (риск малигнизации возрастает до 1,9); - ГМ с атипической пролиферацией эпителия (увеличение риска в 3, а по некоторым данным - в 25 раз). Частота развития рака на фоне пролиферативных форм ГМ зависит от длительности заболевания и периода наблюдения за больным. Причем риск перехода узловой формы в рак колеблется от 9,3 до 12,2 %. Клинически ГМ проявляется болезненным набуханием одной или обеих молочных желез, в ряде случаев с выделениями из сосков различного характера, грубой дольчатос-тью, тяжистостью, множественными уплотнениями, носящими непостоянный характер. При узловой ГМ участки уплотнения, чаще в одной молочной железе, носят постоянный характер и имеют тенденцию к увеличению. Основными диагностическими методами, помимо клинического, являются маммография, УЗИ и пункци-онная биопсия образования (с последующим цитологическим исследованием пунктата), либо открытая биопсия с последующей обязательной морфологической верификацией с применением современных методов морфологического анализа [1, 2, 8]. Дисгормональная патология грудных желез у мужчин с каждым годом привлекает к себе внимание из-за роста заболеваемости и диагностики гиперпластичес-ких и предопухолевых процессов [4]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Определить патоморфологические и молекулярно-биологические характеристики различных форм гинекомастии. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Выполнен анализ биопсийного и операционного материала от 56 больных мужчин с доброкачественной патологией грудных желез, находившихся на лечении в специализированных медицинских онкологических учреждениях г. Москвы и г. Рязани в период с 2009 по 2015 гг. Критериями включения в исследование были: возраст старше 18 лет, признаки ГМ, информированное согласие пациента на участие в исследовании и соблюдение указаний врача. Другие патологические образования зарегистрированы в 9 случаях (липома - в 6, эпидермальная киста - в 3), ввиду чего стали критериями исключения. Возраст больных находился в пределах от 3 до 80 лет. Материал изучали с помощью световой и электронной микроскопии, а также с применением иммуно-гистохимических методик. Материал для световой микроскопии фиксировали в 10%-м забуференном растворе формалина, затем заливали в парафин по обычной методике. Серийные парафиновые срезы толщиной 3 мкм депарафинирова-ли по стандартной схеме, затем окрашивали гематоксилином и эозином. Для электронно-микроскопического исследования материал префиксировали в 2,5%-м растворе глутарового альдегида, постфиксировали в 1%-м растворе 0s04 (рН 7.4), заливали в смесь арал-дита и эпона. Полутонкие срезы окрашивали смесью азура 2 и фуксина. Ультратонкие срезы контрасти рова-ли уранилацетатом и цитратом свинца и изучали в трансмиссионном электронном микроскопе Libra 120 (Carl Zeiss, Германия). Иммуногистохимическое исследование проводили на серийных парафиновых срезах толщиной 2 мкм по стандартной методике с применением следующей панели поликлональных антител фирмы «Dako»: к рецепторам эстрогена (клон 1D5, RTU, мышиные), к рецепторам прогестерона (клон PgR636, RTU, мышиные), к онкопротеину c-erbB-2 (Her2/neu) (поликлональное, рабочее разведение 1:500, кроличьи), к Ki67 (клон MIB-1, RTU, мышиные). Исследование выполнялось по следующей схеме. Срезы депарафинировали в 3 порциях спирта (96°), затем промывали 5 мин в дистиллированной воде, помещали стекла со срезами в пластиковый держатель и погружали в 0.01 М цитратный буфер рН=6.0, после чего осуществляли демаскировку антигенов в микроволновой печи. Демаскировку проводили в два этапа: первые 7 мин при мощности Р = 60, затем 1 мин остывания при открытой дверце, далее 7 мин при мощности Р = 40 (выходная мощность микроволновой печи 700 Вт). После демаскировки оставляли емкость со стеклами остывать при комнатной температуре на 20 мин и промывали в 2 порциях фосфатного буфера по 5 мин, наносили блокирующий реагент (Peroxidase Blocking Reagent, фирма «Dako») на 10 мин, после промывали в дистиллированной воде 5 мин, затем в фосфатном буфере - 5 мин. Далее наносили первые антитела и инкубировали срезы при температуре 25 оС 60 мин. После инкубации срезы промывали в фосфатном буфере и наносили биотинилированые антитела на 10 мин, затем промывали в фосфатном буфере и наносили на срезы Выпуск 3 (59). 2016 33 ЩШгорСз [ЩсмеТКЩ стрептавидин-биотиновый комплекс на 10 мин. После тщательной отмывки трис-буфером срезы обрабатывали хромогенным субстратом (3,3-диаминобензидином в буферном растворе). С диаминобензидином инкубировали 10 мин. Использовали систему визуализации фирмы «Dako» LSAB2 System - HRP. Срезы докрашивали гематоксилином и заключали под покровное стекло с монтирующей средой. Интенсивность пероксидазной метки для каждого цитоплазматического антигена оценивали полуколиче-ственным методом с учетом интенсивности окрашивания и количества антиген-позитивных клеток. Иммуно-гистохимическая реакция оценивалась как негативная, «?» (отсутствие реакции), слабопозитивная, «+» (<10 % окрашенных клеток), умеренная, «++» (>10 % клеток средней интенсивности окраски) и выраженная, «+++» (>50 % клеток высокой интенсивности окраски). Использование каждого вида антител сопровождалось постановкой контрольных реакций на серийных срезах. Морфологическое исследование проводилось с помощью светового микроскопа фирмы «Carl Zeiss» «Axiostar plus». Фотографирование микропрепаратов осуществляли с использованием цифровой камеры AxioCam MRc5 c программой компьютерной обработки изображений AxioVision 4.6.3 «Carl Zeiss». РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Основной клинический симптом при ГМ-увеличение размеров грудной железы, значительно варьирующее во времени - от 2 мес. до 15 лет. При макроскопической оценке интраоперационно удаленных образований на фоне дольчатой жировой ткани с широкими прослойками эластичной белесоватой ткани определяется нечетко ограниченный очаг уплотнения плотно-эластической консистенции, белесоватого волокнистого вида. Размеры узловых образований варьируют от 0,8 до 2,5 см. При микроскопическом исследовании непролиферативная форма протоковых изменений при ГМ характеризуется одиночными и множественными кистами правильной округлой или фестончатой формы. Эпителий протоков и кист кубический или цилиндрический, уплощенный, без явлений пролиферации. Отмечается разрастание волокнистой соединительной ткани и железистых ходов среднего и малого диаметров. Просветы ходов расширены и принимают форму кист, местами содержат детрит. Протоки выстланы многослойным высоким эпителием, уплощающимся в кистозно-трансформированных протоках. Соединительнотканная строма плотная, с небольшим количеством клеточных элементов и редко встречающимися сосудами. Соединительная ткань более рыхлая, в основном, вокруг протоков, располагается концентрически, с очагами ангиоматоза и полнокровными сосудами; среди клеточных элементов можно выявляются лимфоциты, плаз-моциты и мононуклеары (рис. 1). Иммуногистохимическая реакция при выявлении эстрогеновых рецепторов и Ki-67 имела вид от золотисто-желтого до темно-коричневого цвета ядер, с различной интенсивностью окраски. Иммуногистохимическим исследованием установлена незначительная экспрессия Ki-67 (17,35 ± 2,6) %. В более чем 50 % протоковых структур в эпителии выявлялась экспрессия эстрогеновых рецепторов (рис. 2). Рис. 1. Патоморфологическая картина грудной железы при непролиферативной форме гинекомастии. Окраска гематоксилином и эозином х 100 Рис. 2. Экспрессия рецепторов к эстрогену в грудной железе, больного с непролиферативной формой гинекомастии. ИГХ реакция, ДАБ, х 200 При пролеферативной форме ГМ эпителий протоков образует небольшие сосочковые выросты в просветы протоков, местами переходящие в образования типа «криброзных». Отмечается слой миоэпителиаль-ных клеток, расположенных в виде палисада. Мембраны протоков чаще плотные, с участками разрыхления. Железистые протоки обычно окружены полосками рыхлой тонковолокнистой соединительной ткани разной ширины, богатой клетками и сосудами («мантийная ткань»). Помимо околопротоковой стромы различают «опорную» (которая преобладала на препаратах), представленную тяжами толстых коллагеновых волокон (рис. 3, 4). 34 Выпуск 3 (59). 2016 Рис. 3. Типичная патоморфологическая картина грудной железы при пролиферативной гинекомастии. Окраска гематоксилином и эозином х 100 клетками, расположенными в несколько слоев. Верхний слой состоит из эпителиальных высокодифференцированных клеток и клеток, вступивших на путь специфической дифференцировки. Рис. 4. Очаги пролиферации эпителия и миоэпителия и полоски рыхлой тонковолокнистой соединительной ткани, богатые клетками и сосудами при пролиферативной форме гинекомастии. Окраска гематоксилином и эозином х 200 При исследовании маркеров пролиферации установлено увеличение экспрессии Ki-67 (24,8 ± 3,5) %. Уровень экспрессии эстрогеновых рецепторов незначительно увеличивается (38,8 ± 6,5) %. ГМ с атипической внутрипротоковой пролиферацией в протоках и кистах характеризуется развитием микрососочков, клеточных мостиков, солидных и криб-розных структур, образованных мономорфными клетками с овальным или округлым, часто гиперхромным ядром. При иммуногистохимическом исследовании определяется некоторое снижение показателей экспрессии Ki-67 (13,39 ± 8,4) %. Экспрессия эстрогеновых рецепторов в участках ГМ с атипической протоковой гиперплазией носит очаговый характер и определяется лишь в части эпителиальных клеток внутрипротоковых пролифератов (25,88 ± 2,84) % (рис. 5, 6). При ультраструктурном анализе, нами установлено, что стенки протоков образованы эпителиальными Рис. 5. Экспрессия рецепторов к эстрогену в грудной железе, больного с пролиферативной формой гинекомастии. ИГХ реакция, ДАБ, х 200 Рис. 6. Типичная патоморфологическая картина грудной железы при гинекомастии с атипической внутрипротоковой пролиферацией. Окраска гематоксилином и эозином х 100 В большинстве клеток, располагающихся в наружных слоях эпителиального пласта, граничащего с просветом протока, видна дифференцировка цитоплазмы на апикальную и базальную части. На люминаль-ных поверхностях клеток имеются многочисленные мелкие цитоплазматические выросты, в цитоплазме - небольшое количество специфических гранул, содержащих электронноплотный секрет и казеиновые тельца. Цитоплазма клеток содержит также некоторое количество канальцев и профилей гранулярного эндоплаз-матического ретикулума, значительное количество рибосом. В непосредственной близости от ядра много митохондрий со светлым зернистым матриксом, частично редуцированными кристами. В части клеток отмечается появление тонофибрилл в виде нежно-волок Выпуск 3 (59). 2016 35 ЩШгорСз [ЩсмеТКЩ нистых пучков или хаотично расположенных с войлокоподобной сетчатостью. В отдельных клетках видны внутриклеточные канальцы. Плотные межклеточные контакты и соединения типа десмосом наблюдаются преимущественно между наиболее дифференцированными клетками, в основном, в верхних слоях эпителиального пласта. Характерно наличие темных и светлых дифференцированных клеток. Стромальные элементы малочисленны, определяются поля коллагена и наличие свободнолежащих стромальных клеток фибробла-стов и макрофагов (рис. 7, 8). Рис. 7. Ультраструктура грудной железы при гинекомастии. Контрастирование цитратом свинца, х 8500 Рис. 8. Ультраструктура грудной железы при гинекомастии. Контрастирование цитратом свинца, х 10000 Темные клетки встречались не везде, очагово. Мнения о природе этих клеток противоречивы. Некоторые исследователи считают, что их возросшая плотность является результатом высокого уровня содержания рибосом вследствие эстрогенной стимуляции, другие - что варьирование плотности клеток молочной железы выявляет четкие типы клеток с различными функциями, или - что разница цитоплазматической плотности отражает различия в функциональном состоянии клетки. Другой находкой было присутствие пучков толстых филаментов в цитоплазме некоторых эпителиаль ных клеток. Крайне высокая плотность, волнистое распределение, ориентация в связи с десмосомами отличает их от филаментов в миоэпителиоцитах. Такая морфология является полной характеристикой тонофиламен-тов. Существует мнение, что тонофиламенты являются патогномоничным признаком злокачественных опухолей. Изобилие этих филаментов в случае гинекомастии и их ассоциация с темными гранулами, сходными с ке-ратогиалиновыми гранулами эпидермальных клеток, являются свидетельством чешуйчатой метаплазии. Хотя этот эффект эстрогенов не был описан для молочной железы, другие железистые эпителиальные клетки подвергались чешуйчатой метаплазии после воздействия эстрогенов. В строме обнаруживали аккумуляцию аморфного, умеренно плотного вещества вокруг протоков и вблизи кровеносных сосудов. Оно соответствовало рыхлой околопротоковой строме, обнаруженной при световой микроскопии. Считается, что это является результатом возросшего накопления мукополисахари-дов под воздействием эстрогенной стимуляции. Стромальные клетки преимущественно были представлены фиброцитами. Выраженность эндоплазматической сети, рибосом и комплекса Гольджи являлось признаком возросшей функциональной активности. Подобные ми-офибробласты были описаны при различных состояниях, включая рак молочной железы у женщин и рак грудной железы у мужчин [1, 5]. Некоторые считают, что они представляют собой фибробласты, которые, возможно, под воздействием гормональной стимуляции, приобрели особенности гладкомышечных клеток. В нескольких случаях в строме были обнаружены перициты. Из всего вышеперечисленного вытекает тот факт, что уль-траструктурные особенности протоковых клеток в большинстве случаев очень сходны с доброкачественными гиперпластическими состояниями в женской молочной железе, строма при этом составляет главный компонент гинекомастии, и ее ультраструктурные особенности отражают морфологическое проявление эстрогенной стимуляции. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ГМ - доброкачественное поражение грудной железы, наблюдаемая у мужчин в пубертатном, пост-пубертатном периодах и в андропаузе. При изучении рецепторов эстрогенов при пролиферативной форме заболевания (без атипии) их количество (38,01 ± 7,2) % превосходит таковое при непролиферативной форме (34,08 ± 8,72) % и при атипической гиперплазии эпителия (25,88 ± 2,84) %. Показатель пролиферации Ki-67 при пролиферативной форме заболевания (без атипии) составляет (24,8 ± 3,5) %, при непролиферативной форме - (17,35 ± 2,6) % и при атипической гиперплазии эпителия - (13,39 ± 8,4) %. При ГМ установлена пролиферация ЕR+клеток и увеличение доли клеток, одновременно экспрессирующих ЕR и фактор пролиферации Кі67, особенно выражено это при пролиферативных формах ГМ.