IDENTIFICATION OF BURKHOLDERIA CEPACIA AND BURKHOLDERIA PSEUDOMONAS COMPLEX BACTERIA USING VITEK 2, AN AUTOMATED BIOCHEMICAL ANALYZER

Full Text

Identification, Burkholderia, B.cepacia, VITEK 2, Pseudomonas aeruginosa. B. cepacia относится к роду буркхольдерий, грамот-рицательных неферментирующих бактерий, выделенных в 1992 г. в самостоятельный таксон из рода Pseudomonas [8]. Вид B. cepacia является типовым видом рода и относится к IV группе патогенности в соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней». Изоляты «B. cepacia» различного происхождения характеризуются значительной гетерогенностью, что обусловило разделение cepacia-комплекса на геномовары, в дальнейшем получивших статус видов. До 2009 г. их насчитывалось 9, к 2011 г. - уже 17, в настоящее время комплекс представлен 18 отдельными бактериальными видами [2, 6, 7]. Ряд представителей комплекса B. cepacia в настоящее время признаны в качестве основных оппортунистических патогенов респираторного тракта больных муковис-цидозом, хроническим гранулематозом и некоторыми им-мунодефицитными состояниями [4, 5]. Описаны случаи развития некротизирующих пневмоний, абсцессов легких, послеоперационных раневых инфекций и септицемий, инфекций мочевого тракта, возникающих при использовании контаминированных микроорганизмами дезинфектантов, растворов и систем для внутривенного введения лекарств. Приблизительно у 20 % больных, инфицированных B. cepacia, возникает так называемый cepacia-синдром, который характеризуется некротизирующей пневмонией с ли хорадкой, бактериемией и может быстро привести к летальному исходу. Как правило, внутрибольничные вспышки инфекции B. cepacia связаны с недостаточной дезинфекцией изделий медицинского назначения многоразового использования. Данные бактерии могут передаваться от человека к человеку в медицинских и немедицинских учреждениях при прямом и косвенном контактах, а также воздушно-капельным путем [6]. Идентификация микроорганизмов комплекса B. cepacia с использованием методов бактериологического анализа сложна в силу выраженного полиморфизма фенотипических признаков. Для идентификации бактерий в большинстве клинических диагностических лабораторий в настоящее время используются автоматические системы бактериологического анализа, такие как BD Phоenix (Becton Dickinson, США), VITEK и VITEK 2 (bioMerieux, Франция), WalkAway (Dade Behring, США), основанные на сопоставлении биохимических свойств исследуемых штаммов с имеющейся базой данных, содержащей информацию о типичных биохимических профилях всех входящих в нее видов микроорганизмов. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Исследование особенностей идентификации коллекционных штаммов комплекса B. cepacia и установление видовой принадлежности представителей рода Pseudomonas с использованием системы VITEK 2. Выпуск 3 (59). 2016 109 ЩШгорСз [ЩсмеТКЩ МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ В работе были использованы штаммы из коллекции ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора: 9 штаммов комплекса B. cepacia, геномовары которых были определены ранее [1], и 5 штаммов рода Pseudomonas с неустановленной видовой принадлежностью (табл. 1). Определение видовой принадлежности проводили на биохимическом автоматическом анализаторе VITEK 2 (BioMerieux, Франция), с использованием NG-карт, предназначенных для идентификации клинически значимых ферментирующих и неферментирующих гра-мотрицательных палочек и включающих 47 индивидуальных биохимических тестов. Штаммы микроорганизмов выращивали на L-агаре (Difco, США) при температуре 32 °С. Для заполнения соответствующих карт прибора из 18 ч культур готовили суспензию 0,5-0,63 плотности по МакФарланду согласно инструкции производителя bioMerieux (Франция). Время получения результата - 5-10 часов. На каждую исследуемую культуру был получен протокол идентификации микроорганизма с подробной инфор мацией о его биохимической активности. Рассчитывался количественный показатель-относительная вероятность, отражающая степень соответствия полученных результатов типичному профилю биохимической активности каждого вида из базы данных анализатора. Система делала единственный выбор при относительной вероятности 85-99 %. В случае несоответствия биохимического профиля ни одному из имеющихся в базе данных система выдавала сообщение о невозможности идентификации или список вероятных микроорганизмов. В последнем случае лабораторный отчет содержал перечень дополнительных тестов, необходимых для окончательной идентификации. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В результате проведенного анализа с помощью автоматической системы VITEK 2 восемь штаммов комплекса B. cepacia (АТСС 25416, 323, АВ 1934, 8235, 8236, 8238, 3181, 3189) были отнесены к группе B. cepacia (B. Cepacia / B. Vietnamiensis / B. Multivorans / B. stabilis) (табл. 2). Таблица 1 Штаммы, используемые в работе № п/п Штамм Номер геномовара Вид согласно геномовару 1 B. cepacia ATCC 25416 I B. cepacia 2 B. cepacia AB 1934 II B. multivorans 3 B. cepacia 323 III B. cenocepacia 4 B. cepacia 8235 IV B. stabilis 5 B. cepacia 8236 III B. cenocepacia 6 B. cepacia 8238 III B. cenocepacia 7 B. cepacia 8240 III B. cenocepacia 8 B. cepacia 3181 I B. cepacia 9 B. cepacia 3189 I B. cepacia 10 Pseudomonas sp. 5809 - - 11 Pseudomonas sp. 5810 - - 12 Pseudomonas sp. 5811 - - 13 Pseudomonas sp. 5812 - - 14 Pseudomonas sp. 5813 - - Таблица 2 Результаты идентификации микроорганизмов комплекса B. cepacia с использованием VITEK 2 system № п/п Название штаммов коллекции Результаты идентификации 1 B. cepacia ATCC 25416 B. cepacia / B. vietnamiensis / B. multivorans / B.stabilis 2 B. multivorans AB 1934 B. cepacia / B. vietnamiensis / B. multivorans / B. stabilis 3 B. cenocepacia 323 B. cepacia / B. vietnamiensis / B. multivorans / B. stabilis 4 B. stabilis 8235 B. cepacia / B. vietnamiensis / B. multivorans / B. stabilis 5 B. cenocepacia 8236 B. cepacia / B. vietnamiensis / B. multivorans / B. stabilis 6 B. cenocepacia 8238 B. cepacia / B. vietnamiensis / B. multivorans / B. stabilis 7 B. cenocepacia 8240 A. lwoffii 8 B. cepacia 3189 B. cepacia / B. vietnamiensis / B. multivorans / B. stabilis 9 B. cepacia 3181 B. cepacia / B. vietnamiensis / B. multivorans / B. stabilis 10 Pseudomonas sp. 5809 P. aeruginosa / P. putida 11 Pseudomonas sp. 5810 P. aeruginosa 12 Pseudomonas sp. 5811 P. aeruginosa 13 Pseudomonas sp. 5812 P. aeruginosa 14 Pseudomonas sp. 5813 P. aeruginosa 110 Выпуск 3 (59). 2016 Лабораторный отчет по этим штаммам содержал информацию по дополнительным тестам (утилизация сахарозы, наличие бета-галакгозидазы, желатиназы и желтого пигмента), с помощью которых можно было определить эти штаммы до вида. В ряде работ при идентификации штаммов комплекса B. cepacia авторы отмечали ложную идентификацию как на уровне геномовара, так и на уровне вида и рода при использовании анализатора VITEK 2 [3]. В данной работе три штамма B. cenocepacia 323, 8236, 8238 были идентифицированы как другие виды комплекса B. cepacia (B. cepacia / B. Vietnamiensis / B. Multivorans / B. stabilis), что возможно связано с их нестабильным биохимическим профилем. Штамм B. cenocepacia 8240 был неправильно определен прибором как вид A.lwoffii с вероятностью 91 %. В статье Brisse S., et al. было указано, что при идентификации культур комплекса B. cepacia с помощью VITEK 2 в 4 °% случаев анализируемый изолят был отнесен к разным видам неферментирующих грам-негатив-ных бактерий (в том числе и к Acinetobacter spp.) [3]. Ложная идентификация культуры может определяться нехарактерными для типового штамма биохимическими свойствами. Так, B. cenocepacia 8240 отличался от других штаммов этого вида набором таких показателей, как отсутствие ß-N-ацетилглюкозоминидазной и наличие L-пролинариламидазной и тирозинариламидазной активностей, неспособность к утилизации сахарозы и др. Стоит отметить, что в проведенных нами исследованиях по автоматической бактериологической идентификации филогенетически родственных микроорганизмов Burkholderia pseudomallei (возбудителя особо опасного заболевания - мелиоидоза) и Burkholderia mallei (возбудителя особо опасного заболевания - сапа) у части штаммов были выявлены биохимические особенности, заключающиеся в нетипичном результате перечисленных выше тестов. В результате, данные штаммы B. pseudomallei и B. mallei были неправильно идентифицированы как виды B. cepacia и Sphingomonas paucimobilis соответственно. Штаммы рода Pseudomonas sp. были идентифицированы бактериологическим анализатором как P aeruginosa с вероятностью 98-99 °% (5810, 5811, 5812, 5813). Pseudomonas sp. 5809 был отнесен к двум видам P Aeruginosa/P. putida, а лабораторный отчет системы содержал рекомендации по проведению дополнительных тестов для дальнейшей дифференциации (рост при 42 °С, наличие пигмента пиоцианина). Способность к росту при данной температуре, а также наличие сине-зеленого диффундирующего пигмента свидетельствовали о его видовой принадлежности к P. aeruginosa. ЗАКЛЮЧЕНИЕ С использованием автоматического биохимического анализатора VITEK 2 установлено, что большинство исследуемых штаммов различных геномоваров B. cepacia (8 из 9) были идентифицированы как виды комплекса B. cepacia. Более половины (5 из 9) штаммов определены как принадлежащие одному из четырех видов комплекса: B. œpacia /B. Vietnamiensis /B. Multivorans /B. stabilis. Из 47 тестов, заложенных в NG карте прибора, не было отмечено ни одного нетипичного результата, что говорит о типичном биохимическом профиле данных штаммов, характерном для микроорганизмов этого комплекса. Оставшиеся 4 штамма, относящиеся к виду B. cenocepacia анализатором VITEK 2, были ложно идентифицированы как штаммы других видов cepacia-комплекса, при этом один штамм был определен как вид A. lwoffii. Таким образом, при применении VITEK 2 в лабораторной практике для ускоренной идентификации микроорганизмов комплекса B. cepacia следует иметь в виду возможность ошибочного определения их видовой принадлежности. В случаях диагностики заболевания с характерным анамнезом для B. cepacia-инфекции и нетипичными результатами при идентификации выделенной культуры микроорганизмов с помощью автоматической системы VITEK 2 необходимы дополнительные исследования с использованием как традиционных фенотипических (бактериологических, биохимических), так и молекулярногенетических методов. ЛИТЕРАТУРА

About the authors

A. V. Neznamova

Volgograd Research Plague Control Institute

Y. A. Lopasteyskaya

Volgograd Research Plague Control Institute; Volgograd State Medical University

E. V. Molchanova

Volgograd Research Plague Control Institute; Volgograd State Medical University

Email: elenakalinki@yandex.ru

N. P. Ageeva

Volgograd Research Plague Control Institute

D. V. Viktorov

Volgograd Research Plague Control Institute; Volgograd State Medical University

References

Supplementary files