EFFECT OF EXPERIMENTAL CHRONIC ALCOHOL INTOXICATION ON ENDOGENOUS INTESTINAL MICROFLORA

Full Text

В настоящее время уровень потребления алкоголя считается одной из трех наиболее приоритетных проблем в области общественного здравоохранения в мировом масштабе [11, 14]. По данным Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, отравления спиртосодержащей продукцией занимают третье место в структуре острых отравлений и составляют 21,2 % [12]. Наиболее уязвимым для воздействия токсического фактора алкоголя является растущий организм [13]. Несовершенство и незрелость естественных защитных механизмов определяют тяжелые последствия воздействия этилового спирта на детский организм [1, 2, 6]. Согласно современным представлениям, эндогенная интоксикация (ЭИ)-это каскадный, стадийный, способный к прогрессированию генерализованный процесс, который обусловлен накоплением в кровяном русле токсических субстанций в концентрациях, превышающих функциональные возможности естественных систем детоксикации с последующим нарушением других органов и систем организма [3]. ЭИ является одним из типо вых патологических процессов, осложняющим течение большого количества заболеваний и приводящим к развитию полиорганной недостаточности [5]. Особое место в патогенезе ЭИ занимает дисфункция микробиоценозов в тех или иных биотопах человеческого организма, возникающая при различных патологических состояниях. При этом до настоящего времени недостаточно изучен вклад нарушений микробиоценоза кишечника в структуру формирования нарушений резистентности организма. В последние годы определились области, в которых от состояния микробной флоры, выраженности ее нарушений напрямую зависят успех и сама возможность проведения лечения основного заболевания. Нормальная микрофлора способна к осуществлению обезвреживающей функции в отношении многих токсических субстратов и метаболитов (нитраты, ксенобиотики, гистамин, мутагенные стероиды), предохраняя тем самым энтероциты и отдаленные органы от воздействия повреждающих факторов и канцерогенов [7]. Доказано, что негативные изменения микробиоценоза желудочно-кишечного тракта, снижая детоксикационную 40 Выпуск 4 (60). 2016 ©зеторСз ©шПГ ШШ функцию индигенной флоры, увеличивают функциональную нагрузку на печень. В перечне патологических процессов, развивающихся в печени и во внепеченочной билиарной системе, обусловленных транслокацией кишечной микрофлоры и ее токсинов во внутреннюю среду макроорганизма, представлены: неалкогольный сте-атоз, стеатогепатит, неспецифический реактивный гепатит, внутрипеченочный интралобулярный холестаз, печеночно-клеточная дисфункция, воспалительные процессы и дискинетические нарушения внепеченочного билиарного тракта [15]. Таким образом, от выраженности нарушений микробной флоры кишечника напрямую зависят успех и сама возможность проведения лечения хронической алкогольной интоксикации. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Определить динамику изменений микрофлоры кишечника при экспериментальной хронической эндогенной алкогольной интоксикации у крыс разного возраста. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование было выполнено на 40 аутбредных лабораторных крысах-самцах в возрасте 3 и 6 месяцев, что соответствует возрасту 10 и 18 лет у человека [8]. Содержание животных и все манипуляции с ними соответствовали международными нормам и правилам по работе с позвоночными лабораторными животными. Световой цикл в помещениях был инвертирован для исключения негативного влияния суточных биоритмов на пищевое и питьевое поведение животных [10]. Животные были разделены на 4 группы: 2 контрольные, 2 экспериментальные (10 особей) в соответствии с возрастом: I контрольная группа - животные в возрасте 3 месяцев соответствует 10 годам у человека, II контрольная группа - животные 6 месяцам, что соответствует 18 годам у человека, I экспериментальная группа-животные 3 месяцев, II экспериментальная группа-животные 6 месяцев. Контрольные группы содержались в стандартных условиях с постоянным доступом к чистой воде. В экспериментальных группах в качестве единственного источника жидкости использовался 15%-й раствор этанола. На 20-е сутки эксперимента с целью подтверждения алкоголизации организма животного проводился тест предпочтения этанола [4]. Для этого животные помещались в индивидуальные клетки на 2,5 часа. После 2-часовой водно-пищевой депривации в клетку помещались две поилки: с чистой водой и с 15%-м раствором этанола. В течение следующих 30 мин подсчитывались объемы выпитых жидкостей и общее время контакта с каждой из поилок. После измерения объема выпитой жидкости высчитывался коэффициент предпочтения алкоголя (D = 100 %^алк / Vобщ). Оценка состояния микрофлоры кишечника крыс производилась дважды: до начала эксперимента (по истечению срока карантина) и на 40-е сутки эксперимента. Фекалии собирали непосредственно из прямой кишки в стерильный контейнер методом массирования кишечника для исключения попадания сторонней микрофлоры и мочевых осадков в образец. Микрофлора кишечника оценивалась методом бактериологического посева по стандартным методикам [7, 8]. В качестве объектов микробиологического исследования были выбраны Bifidobacterium spp., Lactobacterium spp., Escherichia coli, Escherichia coli hemolizating, Enteroccocus spp., Candida spp., Proteus spp. и Staphylococcus spp. Статистическая обработка производилась при помощи программы GraphPad Prism 5.0; проверка распределения осуществлялась по критериям Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка, межгрупповые различия оценивались по U-критерию Манна-Уитни и при помощи двухфакторного дисперсионного анализа с пост-хок тестом Ньюмена-Кеулса. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ При проведении теста предпочтения были обнаружены изменения в питьевом поведении крыс, подвергнутых хронической добровольной алкоголизации. Так, в I и II экспериментальных группах было выявлено достоверное увеличение абсолютных объемов потребления воды и 15%-го раствора этанола (рис. 1). Рис. 1. Динамика питьевого поведения крыс на фоне добровольной хронической 20-дневной алкоголизации Данные изменения связаны с развитием полидипсии как симптома алкогольной интоксикации [11]. При этом в экспериментальной группе к 20-м суткам эксперимента была отмечена выраженная тенденция (p = 0,0811) к повышению коэффициента предпочтения алкоголя, что может отражать успешное воспроизведение не только хронической алкогольной интоксикации, но и формирование алкогольной зависимости у крыс I и II экспериментальных групп [4] (рис. 2). Констатация данного факта стала критерием начала проведения лабораторных исследований состояния микрофлоры в период органической и психической алкогольной зависимости. Выпуск 4 (60). 2016 41 ІШторСз Проведенное микробиологическое исследование выявило изменения в составе микробной флоры I и II контрольных групп крыс, I и II экспериментальных группах. В I и II контрольных группах наблюдалась адаптационная стабилизация микрофлоры кишечника, соответствующая периоду пребывания экспериментальных животных на карантине (табл.). При анализе результатов микробиологического исследования в I и II опытных группах было выявлено, что пул Bifidobacterium spp. был в пределах нормы и составил 2,2*108-1*108 КОЕ (рис. 3). Содержание Lactobacterium spp. также было выявлено в пределах нормы 2,2* 107-1*107 КОЕ (рис. 4). В I и II экспериментальных группах было выявлено достоверное увеличение количества патогенной флоры. Так, при анализе непробиотических штаммов на 40-е сутки добровольной алкоголизации крыс по сравнению с нормой было показано статистически досто- Рис. 2. Питьевое поведение и предпочтение алкоголя у крыс на фоне добровольной хронической 20-дневной алкоголизации, *p < 0,05; **p < 0,01 Сравнительная динамика микробиоты кишечника во время адаптационного периода, Log10 (КОЕ/мл), M ± m Микрофлора кишечника I контрольная группа II контрольная группа при поступлении по окончании карантина при поступлении по окончании карантина Bifidobacterium spp. 8,63 ± 0,33 8,42 ± 0,21 8,33 ± 0,22* 8,18 ± 0,23 Lactobacterium spp. 7,08 ± 0,53 7,75 ± 0,11 7,33 ± 0,17 7,00 ± 0,39 E. coli. 6,75 ± 0,13 7,19 ± 0,43 6,92 ± 0,08 7,38 ± 0,36 E. coli hemolizating. 3,33 ± 2,46 3,17 ± 0,69 3,33 ± 0,71 3,83 ± 0,11 Enterococcus spp. 5,58 ± 1,16 5,25 ± 0,54 6,50 ± 0,22 6,33 ± 0,42 Proteus spp. 0 0 0 0 Staphylococcus spp. 1,00 ± 0,43 0,50 ± 0,34 1,08 ± 1,62 0,83 ± 0,44 Candida spp. 0 0 0 0 Рис. 3. Изменение числа КОЕ Bifidobacterium spp. в фекалиях крыс на фоне добровольной хронической 40-дневной алкоголизации Рис. 4. Изменение числа КОЕ Lactobacterium spp. в фекалиях крыс на фоне добровольной хронической 40-дневной алкоголизации 42 Выпуск 4 (60). 2016 верное снижения Escherichia coli, которое составило 1,2*107-2,1 *105 КОЕ (рис. 5). Рис. 6. Изменение числа КОЕ Enteroccocus spp. в фекалиях крыс на фоне добровольной хронической 40-дневной алкоголизации Рис. 7. Изменение числа КОЕ Staphylococcus spp. в фекалиях крыс на фоне добровольной хронической 40-дневной алкоголизации По результатам оценки изменения уровня Escherichia coli hemolizating прослеживалась более выраженная тенденция увеличения титра (1 *107-1 *106 КОЕ) (рис. 8). Рис. 5. Изменение числа КОЕ Escherichia coli. В фекалиях крыс на фоне добровольной хронической 40-дневной алкоголизации Также было выявлено повышение Enteroccocus spp. 1,2*107-1,1*107 КОЕ (рис. 6) и ряда штаммов Staphylococcus spp. 1 *102-1 *101 КОЕ в различных концентрациях (рис. 7). Рис. 8. Изменение числа КОЕ Escherichia coli hemolizating в фекалиях крыс на фоне добровольной хронической 40-дневной алкоголизации Рис. 9. Изменение числа КОЕ Candida spp . в фекалиях крыс на фоне добровольной хронической 40-дневной алкоголизации При проведении добровольной алкоголизации в группах крыс были выделены микроорганизмы семейства Proteus spp. в различных концентрациях (1,1 *102- 1,3*101) (рис. 10). Рис. 10. Изменение числа КОЕ Proteus spp. в фекалиях крыс на фоне добровольной хронической 40-дневной алкоголизации Выпуск 4 (60). 2016 43 ЩШгорСз [ЩсмеТКЩ ЗАКЛЮЧЕНИЕ 1. Проведение теста предпочтения при экспериментальном моделировании хронической алкогольной интоксикации является важным методологическим дополнением, определяющим критерии достижения стадии органической и психической алкогольной зависимости. При этом алкоголизация достигается к 20-м суткам экспериментальной модели. 2. При экспериментальном исследовании микрофлоры кишечника важным этапом, определяющим достоверность результатов является учет периода адаптационной стабилизации микрофлоры за время период пребывания животного в карантине. 3. Хроническая эндогенная алкогольная интоксикация у крыс I и II экспериментальных групп сопровождается изменением равновесия биоценоза кишечника в сторону патогенной флоры. При этом наиболее выраженный сдвиг биоценоза в сторону патогенной флоры наблюдается у животных старшей возрастной группы - II экспериментальная группа. 4. Состояние микрофлоры кишечника является важным функциональным звеном резистентности организма, учет изменений которой является значимой составляющей персонализированного подхода к определению тактики лечения детей с хронической алкогольной интоксикацией. ЛИТЕРАТУРА

About the authors

L. P. Knyshova

Volgograd state medical university; GBU VMNTS; GBU VMNTS

Email: knyshova-liliya@inbox.ru

S. V. Poroysky

Volgograd state medical university; GBU VMNTS

A. T. Yakovlev

SRI pharmacology

E. I. Morkovin

GBU VMNTS; SRI pharmacology

References

Supplementary files