MORPHOLOGICAL EVALUATION OF EXPERIMENTAL MODEL OF L-NAME INDUCED ENDOTHELIAL DYSFUNCTION

Full Text

Роль дисфункции эндотелия в прогрессировании атеросклероза и развитии гиперплазии интимы не вызывает сомнений и в настоящее время функциональному состоянию эндотелия (ФСЭ) придается большое значение в изучении этиологии, патогенеза облитери-рующего атеросклероза, прогрессировании заболевания, развитии осложнений [1, 2, 7]. По мнению ряда авторов, основное звено патогенеза рестеноза зоны сосудистых анастомозов - это дисфункция эндотелия [1, 2]. Основным активным метаболитом, определяющим функциональное состояние эндотелия, большинство авторов признает оксид азота (II) (NO), являющийся локальным тканевым гормоном с множественными эффектами - от противовоспалительного до сосудистых эффектов и стимуляции ангиогенеза [3, 4, 5]. Также в комплексной оценке ФСЭ целесообразно учитывать компоненты перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты [3, 5]. Одним из проявлений эндотелиальной дисфункции в послеоперационном периоде является гиперплазия неоинтимы в зоне реконструкции [6, 7]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Определить эффективность экспериментального моделирования и механизмы развития L-NAME-инду-цированной эндотелиальной патологии. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты выполнены на 10 беспородных кошках, массой от 3,0 до 4,5 кг. Все работы проводились в соответствии с этическими нормами, руководствуясь правилами и приказами: «Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1986) и приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 г., Животные содержались в стандартных условиях вивария, получали стандартный рацион питания и воду ad libitum. Моделирование L-NAME-индуцированной эндотелиальной дисфункции осуществлялось путем введения в течение 7 дней ^нитро^-аргинин метиловый эфир (L-NAME) один раз в сутки внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг. Животных выводили из эксперимента через 3, 5 и 7-е сут. Умерщвление животных проводили перед ози- 86 Выпуск 4 (60). 2016 ровкой золетила («Virbac Sante Animale», Франция), вводимого внутримышечно в дозе 50 мг/кг Выделенный сосудистый ствол фиксировали в 10%-м растворе нейтрального забуференного формалина (фосфатный буфер, pH = 7,2-7,4), обезвоживали в серии эта-нолов возрастающей концентрации, с применением изопропанола, заливали в парафин. Изготавливали тотальные серии срезов (10 мкм), которые окрашивали гематоксилином и эозином («Biovitrum», Россия). Гистологические срезы также окрашивали пикрофуксином по ван Гизону и по методу Маллори по общепринятой методике. Морфологическое исследование проводили с помощью микроскопа Leica DMI 4000 B с видеозахватом камерой Leica. Для проведения трансмиссионной электронной микроскопии, фрагменты сосудистой стенки фиксировали в 2,5%-м растворе глутаральдегида («Fluka», Швейцария) с постфиксацией в 1 %-м растворе OsO4 («Fluka», Швейцария). Контрастирование проводили 2,5%-м спиртовым раствором (70є этиловый спирт) уранила ацетата («Fluka», Швейцария). Подготовленные кусочки заливали в смесь смол Эпона и Аралдита М («Fluka», Швейцария). Полу-тонкие срезы окрашивали азуром II и эозином. Ультратон-кие срезы дополнительно контрастировали солями свинца и уранилацетатом по Рейнольдсу (Уикли Б., 1975 г.). Изучение препаратов проводили на трансмиссионном электронном микроскопе «Libra 120» с автоматическим сканированием изображений («Carl Zeiss», Германия). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ На 3-и сутки от начала опыта морфологическая и ультраструктурная картина была практически однотипной. При световой микроскопии препаратов отмечалось наличие дистрофических и некробиотических изменений в стенке сосуда, выраженный интерстициальный отек, сглаживание эндотелиальной выстилки, истончение эндотелия, сморщивание эндотелиоцитов, а во многих местах и вообще отсутствие эндотелиальной выстилки в просвете сосуда. В субэндотелиальном слое наблюдается набухание волокон, интерстициальный отек, стертость внутренней эластической мембраны, ее базофилия, сегментация эластических волокон. При ультраструктурной оценке отмечается наличие дистрофических и деструктивных изменений органелл. Ядра эндотелиоцитов имели фестончатый вид (рис. 1). Ядерная мембрана образовывала глубокие инвагинации, теряла четко контурированную структуру, была разрыхлена. Перинуклеарные пространства неравномерно расширены. Ядерный хроматин находился преимущественно в конденсированном состоянии. Его осмиофильные глыбки плотным кольцом концентрировались вдоль ядерной мембраны. Центральная часть матрикса ядра содержала гранулы деконденсирован-ного хроматина и обладала низкой электронной плотностью. Цитоплазма в перинуклеарной области имела более высокую электронную плотность, в ней присутство вало небольшое количество деструктивно измененных органелл (рис. 2). Рис. 1. Дистрофические и деструктивные изменения органелл. Ядра эндотелиоцитов фестончатого вида Рис. 2. Гомогенный матрикс митохондрий, лизированные крипты, деструкция наружных мембран Митохондрии эндотелиоцитов обладали средней электронной плотностью и гомогенным матриксом. Кристы значительного числа митохондрий не выявлялись. Отдельные митохондрии содержали тотально лизированные кристы и грубо-волокнистый матрикс. Наружные мембраны имели очаги деструкции (рис. 3). Цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулума были сильно расширены и представляли собой электронно-прозрачные вакуоли. На мембранах практически отсутствовали рибосомы, а в цитоплазме выявлялось большое количество рибосом и полисом. Гиалоплазма эндотелиоцитов была умеренно просветлена. Наблюдался очаговый лизис мембран гранулярной эндоплазматической сети. Пластический цитоплазматический комплекс Гольджи был подвержен редукции и представлен отдельно лежащими, беспорядочно ориентированными гладкими мембранами, вблизи которых располагались крупные электронно-прозрачные вакуоли, первичные и вторичные лизосомы, а также включения липидов. Выпуск 4 (60). 2016 87 При ультраструктурном исследовании отмечается эндотелиоциты с тотальной деструкцией всех внутриклеточных органелл и мембранных структур (рис. 4, 5). Рис. 3. Гиалоплазма эндотелиоцитов умеренно просветлена, очаговый лизис мембран гранулярной эндоплазматической сети, комплекс Гольджи с признаками редукции Таким образом, к 3-м стукам происходит наличие выраженных глубоких дистрофических изменений, затрагивающих все структурные элементы сосудов, в особенности эндотелий, что запускает стойкий процесс его дисфункциональных изменений. На 5-е и 7-е стуки морфологическая и ультраструктурная картина была однотипной, но отличалась от таковой в период 3-х суток. При световой микроскопии отмечено, что претерпевают изменения все слои сосуда, от интимы, до ад-вентиции. Интима рельефная, резко утолщена, за счет отека, с выраженными дистрофическими изменениями и наличием разволокнения волоконного каркаса, что создает наличие оптически пустых ячеек, признаки плаз-моррагии. Эндотелий неравномерно расположенный, с набуханием отдельных клеток. Внутренняя эластическая мембрана неравномерно утолщена, с наличием глубоких складок и фрагментацией. Средняя оболочка и адвентиция с явлениями мозаичной пикрино и фуксинофилии, эластический компонент фрагментирован, с набухание волокон и нередкими фигурами деформации волоконного каркаса. Адевенти-ция, преимущественно вокруг собственных сосудов оча-гово гипертрофированна, с наличием лимфоплазмоци-тарной инфильтрацией, с примесью эозинофилов, преимущественно вокруг собственных сосудов. На 7-е сутки в адвентиции изменения более выражены. Хотя, эндотелий утолщен, на многих участках слущен, субэндотелиальный слой набухший, стертость внутренней эластической мембраны, ее базофилия, сегментация эластических волокон. В адвентиции определяется полнокровие и кровенаполенение капилляров адвентиции и гиперхромазией эндотелия капилляров, в некоторых сосудах адвентиции лейкостазы и эритродиапедез. Основное вещество адвентиции и средней оболочки с базофилией, сегментарными разрывами коллагеновых фибрилл, формированием концентрических структур. Рис. 4. Эндотелиоциты с тотальной деструкцией всех внутриклеточных органелл и мембранных структур Рис. 5. Участки разрушения базальной мембраны, формирование цитоплазматических выростов Ядра таких клеток были пикнотичны и обладали высокой электронной плотностью, создаваемой глыб-ками конденсированного. Базальная мембрана имела неравномерную толщину и среднюю электронную плотность. В структуре базальной мембраны выявлялись вакуолеподобные образования, не ограниченные мембраной. Кроме того, обнаруживались участки разрушения базальной мембраны, хроматина, расположенными вблизи ядерной мембраны (рис. 6). В центральной области матрикса ядра находилась электронно-прозрачная субстанция с включениями единичных гранул деконденсированного хроматина. Ядерная мембрана была разрыхленной, со множественными очагами лизиса. В перинуклеарной области цитоплазмы 88 Выпуск 4 (60). 2016 эндотелиоцитов располагались деструктивно измененные митохондрии. Наблюдался тотальный лизис крист и наружных мембран. Гранулярный эндоплазматический ре-тикулум был подвержен фрагментации. Рибосомы, как свободно лежащие в цитоплазме, так и связанные с мембранами гранулярного эндоплазматического ретикулума, практически отсутствовали. Редукция пластинчатого цитоплазматического комплекса Гольджи сопровождалась разрыхлением и лизисом его мембран. Рис. 6. Отек и гипертрофия эндотелиальных клеток, деструкция митохондрий, расширение и отек перикапиллярного пространства Таким образом, при исследовании ультраструктуры сосудистой стенки обнаружены адаптивные и патологические изменения эндотелиальных клеток. К адаптивно-компенсаторным процессам относились набухание и деструкция отдельных митохондрий, увеличение ядерной поверхности эндотелиоцитов. Патологические изменение эндотелиоцитов проявлялись отеком и гипертрофией эндотелиальных клеток, деструкцией митохондрий, расширением и отеком перикапиллярного пространства, что является морфологическим эквивалентом функциональных (обратимых) изменений окружающих тканей. Нарушения ультраструктуры кровеносных сосудов состоит в повреждении эндотелиальных клеток, отеке перикапиллярного пространства, разрыхлении и нарушении целостности базальной мембраны кровеносных капилляров. Эти изменения сопровождаются увеличением количества сладжиро-ванных тромбоцитов и эритроцитов с явлениями гемолиза, усилением проницаемости форменных элементов крови в перикапиллярное пространство, формированием микротромбов. Все это свидетельствует о значительном нарушении микрогемодинамики в тканях при реперфузии. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, электронно-микроскопическими исследованиями показано, что к 7-м суткам развиваются изменения субмикроскопической архитектоники эндотелиальных клеток, в результате чего возникает эндотелиальная дисфункция. Ведущим звеном в развитии патологии сосудов на ультраструктурном уровне является митохондриальная недостаточность эндотелиоцитов, структурно проявляющаяся лизисом наружных мембран и крипт этих органелл, что влечет за собой дефицит био энергетического обеспечения внутриклеточных синтетических реакций и репаративных процессов. Нарушения ультраструктурной организации гладких миоцитов в области формирования тромбов свидетельствуют о невозможности поддерживать оптимальный тонус сосудов. Выбранная методика L-NAME индуцированной эндотелиальной патологии отличается высокой воспроизводимостью и адекватными результатами. ЛИТЕРАТУРА

About the authors

A. V. Shilov

Scientific-Research Institute of Human Morphology

M. V. Mnihovich

Ryazan State Medical University named after Academician Pavlov; Scientific-Research Institute of Human Morphology; Medical University Russian National Research Medical University Ministry of Health of Russia

Email: mnichmaxim@yandex.ru

R. E. Kalinin

Ryazan State Medical University named after Academician Pavlov

I. A. Suchkov

Ryazan State Medical University named after Academician Pavlov

L. V. Kakturskiy

Scientific-Research Institute of Human Morphology

References

Supplementary files