THE STRUCTURAL FEATURES OF THE HIPPOCAMPUS OF RATS WITH THE EXPRESSION OF HEAT SHOCK PROTEINS IN THE MODELING HYPERTENSIVE ENCEPHALOPATHY

Full Text

Изучение реакции различных отделов головного мозга на ишемию при артериальной гипертензии, выявление закономерностей структурно-функциональной перестройки, механизмов повреждения нейронов и меж-нейрональных связей остаются на сегодняшний день одной из важных проблем медицины [3]. Исследование морфологической реорганизации нейронов необходимо для полного понимания и теоретического обоснования патогенетических механизмов повреждения, что имеет прикладное значение для прогноза и подхода к оценке репаративных способностей различных структур головного мозга при ишемии [6]. Структуры лимбической системы, отличающиеся по морфологическим и функциональным признакам, играют важную роль в возникновении и прогрессировании нарушений эмоциональной сферы на различных стадиях сосудистой деменции [5]. Гиппокамп принимает участие в реализации механизмов памяти и внимания, отвечает за формирование и регуляцию когнитивных навыков, что, в конечном счете, во многом определяет качество жизни [1, 4]. С другой стороны, нейроны пирамидного слоя гиппокампа являются наиболее чувствительными к гипоксии [2, 6]. При моделировании транзиторной ишемии в гиппокампе отмечается формирование селективных полей апоптоза [10]. Известно, что белки теплового шока (HSP, шапе-роны) обладают цитопротекторными свойствами [7], обеспечивают стабильность белка, контроль качества сборки пептидных цепей, деградации аномально собранных белковых молекул [9, 12]. Нейроны головного мозга обладают различной чувствительностью к гипокси-ческому воздействию и способностью к выработке белков теплового шока, в частности HSP 70 и HSP 90, способствующих защите нейронов от повреждения при ишемии и ишемии-реперфузии [2]. Однако патоморфологические изменения при моделировании различных форм ЦВБ, в частности, гипертензивной энцефалопатии, молекулярные нейропротекторные механизмы остаются малоизученными. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Оценка морфометрических особенностей гиппокампа крыс при моделировании гипертензивной энцефалопатии с учетом экспрессии белков теплового шока HSP 70 и HSP 90. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Работа выполнена на 12-месячных крысах-сам-ках линии Wistar (n = 20), полученных из питомника лабораторных животных (Рапполово). Животные были разделены на две группы: 1-я - контрольные крысы (n = 10), 2-я - крысы c моделируемой в течение 4 недель гипертензивной энцефалопатией (n = 10). Содержание животных соответствовало правилам лабораторной практики (GLP) и Приказу МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». При проведении экспериментов учитывались требования комиссии по проблеме этики отношения к животным Российского национального комитета по биоэтике при Российской академии наук; и этические нормы, признанные мировым сообществом, и изложенные в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных». Моделирование гипертензивной энцефалопатии осуществляли на экспериментальных животных путем создания перегрузок в каудо-краниальном векторе с помощью специальной установки. Установка представляет собой металлический стол с агрегатами и механизмами, позволяющими создавать и плавно регулировать гравитационное воздействие от 0 до 20 G. В серии предварительных испытаний была определена оптимальная величина нагрузки 9 G, позволяющая воспроизвести изменения, характерные для гипертен-зивной энцефалопатии. Животных помещали в пеналы центрифуги в строго каудо-краниальном направлении и подвергали гравитационному воздействию силой 9G в течение 5 минут дважды в день с интервалом в 12 часов. На 1-е, 8-е, 15-е, 22-е и 28-е сутки эксперимента оценивалось психоневрологическое состояние животных. Для оценки неврологического статуса определяли сохранность основных рефлексов (мышечная сила, отрицательный геотаксис, реакция на акустический стимул, пинеальный и зрачковый рефлексы, отсутствие/наличие судорог, параличей, гипертонуса). Поведенческий статус, когнитивные и мнестические функции у животных оценивали с помощью стандартного набора тестов: «Открытое поле» (ОП), «Условный рефлекс пассивного избегания» (УРПИ), «Тест экстраполяционного избавления» (ТЭИ). На 29-е сутки животных выводили из эксперимента с использованием в качестве наркоза хлоралгидра та, декапитировали и забирали образцы головного мозга. Головной мозг фиксировали в 10 % забуференном формалине, с дальнейшим обезвоживанием в батарее спиртов и изготовлением парафиновых блоков. Срезы толщиной 4-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, тионином по методу Ниссля. Иммуногистохими-ческое исследование проводили непрямым пероксидаз-но-антипероксидазным методом с использованием поликлональных антител к белкам теплового шока с молекулярной массой 70 кДа (HSP70) и 90 кДа (HSP90) (1:100 Thermo Scientific. Fremont, СА) согласно протоколу производителя. Исследовали зоны СА1, СА2, СА3 и СА4 пирамидного слоя гиппокампа путем подсчета основных морфометрических параметров: удельного количества (УК) нейронов с гиперхромией цитоплазмы и измененной формой перикариона, средних площадей ядер и перикарионов нейронов, удельную площадь (УП) нейронов пирамидного слоя. Уровень экспрессии оценивали с помощью подсчета удельного количества (УК) нейронов с экспрессией иммунореактивного материала (ИРМ) в зонах СА1, СА2, СА3 и СА4 пирамидного слоя гиппокампа с использованием программы «Видео-тест-Морфо-4» (Россия). Исследование микропрепаратов проводилось с помощью микроскопа «Micros» (Austria), фотодокументирование осуществляли камерой «Olympus» (Japan). Статистическую обработку данных проводили с использованием пакетов программ Statistica 6,0 (StatSoft, USA). Обобщенные данные представляли в виде медианы (Me) с указанием интерквар-тильного интервала [Q1 ;Q3], где Q1 - 25 процентиль, Q3 - 75 процентиль. Различия между группами оценивали по критерию Манна-Уитни (Mann-Whitney, U-test) и считали статистически значимыми при p < 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ При гистологическом исследовании в зоне СА1 пирамидного слоя гиппокампа животных 2-й группы (подвергнутые гравитационному воздействию) был обнаружен выраженный перицелюлярный (преимущественно вокруг глиальных клеток) и периваскулярный отек. Перикарионы нейронов пирамидного слоя приобретали веретеновидную или близкую к веретеновидной форму, наблюдалась резкая гиперхромия цитоплазмы перикарионов. В микроциркуляторном русле наблюдались эритроцитарные стазы и полнокровие, а также плазматическое пропитывание стенки сосудов. Помимо этого, отмечались участки очагового выпадения нейронов со снижением их удельной плотности, а также менее плотное прилегание нейронов пирамидного слоя, чем в группе контрольных животных. Отмеченные наблюдения носили более резкий характер в гиппокампе левого полушария и выражались в большей интенсивности гиперхромии перикарионов. УК гиперхромных нейронов в зоне СА1 пирамидного слоя гиппокампа составило 74,6 [69, 3; 81, 5] %, что на 59,7 % Выпуск 4 (60). 2016 91 ЩШгорСз [ЩсмеТКЩ больше, чем в группе контрольных животных (p < 0,01). Морфометрическое исследование выявило незначительное увеличение средней площади перикарионов пирамидных нейронов зоны СА1 гиппокампа в опытной группе на 2,9 % (р > 0,05). В то же время отмечалось уменьшение средней площади ядер в экспериментальной группе на 16,3 % (p < 0,05), а также увеличение средней площади цитоплазмы на 46,8 % (p< 0,01) по сравнению с группой контроля. УП нейронов пирамидного слоя зоны СА1 во 2-й группе снизилась на 20,6 % по сравнению с контрольной группой (p < 0,01). При иммуногистохимическом исследовании у животных 2-й группы в пирамидном слое СА1 зоны гиппокампа УК нейронов с цитоплазматической экспрессией ИРМ увеличивалось на 2,9 % (p < 0,05) и составило 51 %. На фоне выраженного перицеллюляр-ного и периваскулярного отека цитоплазматическая экспрессия носила, преимущественно, выраженный, а в отдельных нейронах - умеренно выраженный характер. Отмечено значительное увеличение количества нейронов с выраженной экспрессией ИРМ по сравнению с контрольной группой. В молекулярном и радиальном слоях выраженная цитоплазматическая экспрессия отмечалась в перикарионах нейронов, дендритах, а также в глиальных клетках. В st. oriens отмечалась выраженная экспрессия в цитоплазме перикарионов нейронов. Иммуногистохимическое исследование экспрессии белков теплового шока с молекулярной массой 90 кДа (HSP 90) в зоне СА1 пирамидного слоя гиппокампа крыс 2-й группы выявило незначительное усиление экспресии. Преимущественно слабо выраженная экспрессия в контрольной группе сменялась на преимущественно умеренно выраженную в группе животных с моделируемой гипертен-зивной энцефалопатией. Было выявлено увеличение УК иммунопозитивных нейронов на 2,4 % по сравнению с контрольной группой (p < 0,05). В зоне СА2 пирамидного слоя гиппокампа животных 2 группы наблюдались схожие патологические изменения: выраженный отек со спонгиоформной деформацией, локализующийся вокруг глиальных клеток, значительное разнообразие в строении перикарионов нейронов пирамидного слоя, большая часть которых приобретала веретеновидную форму с гиперхромией цитоплазмы. УК гиперхромных нейронов в зоне СА2 пирамидного слоя гиппокампа составило 74,8 [55, 0; 84, 81], что на 68,02 % больше, чем аналогичный показатель в 1 группе (p < 0,001). При морфометрическом исследовании зоны СА2 гиппокампа животных из 2-й группы, было обнаружено уменьшение средней площади перикарионов нейронов пирамидного слоя на 36,54 % (p < 0,001). Средняя площадь ядер нейронов пирамидного слоя опытных животных уменьшилась на 39,7 % по сравнению с контролем (p < 0,001). Средняя площадь цитоплазмы перикарионов достоверно не изменялась. УП нейронов пирамидного слоя зоны СА2 снизилась в группе животных с моделируемой гипертензивной энцефалопатией на 13,95 % (p < 0,01). При иммуногистохимическом исследовании с использованием антител к HSP70 в зоне СА2 пирамидного слоя гиппокампа крыс 2-й группы обнаружено увеличение УК нейронов с цитоплазматической экспрессией ИРМ на 8,4 % (p < 0,01). Экспрессия в данной зоне носила преимущественно умеренно выраженный характер и определялась как в нейронах пирамидного слоя, так и в отростках, а также в части глиальных клеток. При иммуногистохимическом исследовании зоны СА2 пирамидного слоя гиппокампа крыс 2-й группы с использованием антител к HSP90 достоверных изменений по сравнению с контролем выявлено не было. При морфометрическом исследовании зоны СА3 пирамидного слоя гиппокампа животных из 2-й группы выявлено уменьшение средней площади перикари-онов на 15,33 % (p < 0,01), уменьшение средней площади ядер нейронов на 17,8 % (p < 0,01) по сравнению с контрольной группой. УК поврежденных (гиперхромных) нейронов составило в данной зоне 76,8 [72, 5; 79, 9], увеличившись, таким образом, на 63,3 % по сравнению с контролем (p < 0,05). УП нейронов пирамидного слоя снизилась в опытной группе на 15,7 % (p < 0,01). У экспериментальных животных при иммуногистохимическом исследовании с использованием антител к HSP70 в зоне СА3 гиппокампа УК нейронов пирамидного слоя с цитоплазматической экспрессией ИРМ увеличивалось на 14 % (p < 0,01), составив, таким образом, 47,1 %. В радиальном слое ИРМ выявлялся в части апикальных ден-дритов, отмечалась выраженная цитоплазматическая экспрессия. При иммуногистохимическом исследовании зоны СА3 пирамидного слоя гиппокампа животных 2-й группы с использованием антител к HSP90 достоверных отличий от контрольной группы не обнаружено. В зоне СА4 пирамидного слоя гиппокампа животных 2-й группы морфометрический анализ выявил уменьшение средней площади перикарионов на 35,4 % (p < 0,01), а также уменьшение средней площади ядер нейронов на 45,5 % (p < 0,001), достоверного изменения средней площади цитоплазмы выявлено не было. УК гиперхромных нейронов пирамидного слоя в зоне СА4 составило 70,96 % [58, 83; 81, 17], что на 66,57 % больше, чем в контрольной группе (p < 0,001). Также отмечено снижение УП нейронов пирамидного слоя на 11,07 % (p < 0,01). При иммуногистохимическом исследовании с использованием антител к HSP70 в зоне СА4 пирамидного слоя гиппокампа крыс 2-й группы обнаружено увеличение УК нейронов с цитоплазматической экспрессией ИРМ на 5,1 % (p < 0,05) по сравнению с контрольной группой. Экспрессия в данной зоне носила преимущественно выраженный и умеренно выраженный характер. При иммуногистохимическом исследовании зоны СА4 пирамидного слоя гиппокампа крыс 2-й группы с использованием антител к HSP90 обнаружена тенденция к усилению экспрессии ИРМ, УК иммунопозитивных нейронов в экспериментальной группе увеличилось на 1,9 % (p > 0,05) (табл. 1, 2). 92 Выпуск 4 (60). 2016 ©зеторСз [ioinijf3 ШШ Таблица 1 Изменения морфометрических параметров в пирамидном слое гиппокампа животных с моделируемой гипертензивной энцефалопатией Параметр Группа 1 (контроль) Группа 2 (гипертензивная энцефалопатия) СА1 Удельное количество гиперхромных нейронов, % 14,9 [11, 3; 16, 9] 74,6 [69, 3; 81, 5] Средняя площадь перикариона нейрона, мкм2 107,6 [95, 4; 115, 5] 110,7 [98, 8; 119, 4] Средняя площадь ядра нейрона, мкм2 70,1 [59, 8; 82, 5] 58,7 [46, 6; 67, 7] Удельная плотность нейронов, % 45,3 [41, 6; 48, 5] 24,7 [22, 7; 27, 3] СА2 Удельное количество гиперхромных нейронов, % 6,78 [4, 9; 8, 21] 74,8 [55, 0; 84, 81] Средняя площадь перикариона нейрона, мкм2 94,44 [87, 32; 102, 24] 59,9 [56, 82; 81, 45] Средняя площадь ядра нейрона, мкм2 62,05 [59, 11; 70, 75] 37,4 [33, 95; 49, 79] Удельная плотность нейронов, % 38,96 [29, 0; 43, 37] 25,01 [22, 43; 28, 35] СА3 Удельное количество гиперхромных нейронов, % 13,5 [9, 5; 16, 3] 76,8 [72, 5; 79, 9] Средняя площадь перикариона нейрона, мкм2 118,23 [99, 4; 129, 61] 100,1 [85, 54; 116, 2] Средняя площадь ядра нейрона, мкм2 78,27 [64, 4; 91, 83] 64,3[55, 72; 74, 8] Удельная плотность нейронов, % 39,5 [31, 1; 46, 3] 23,8 [17, 9; 30, 1] СА4 Удельное количество гиперхромных нейронов, % 4,39 [2, 9; 7, 02] 70,96 [58, 83; 81, 17] Средняя площадь перикариона нейрона, мкм2 149,5 [137, 71; 171, 3] 96,6 [79, 94; 111, 84] Средняя площадь ядра нейрона, мкм2 89,26 [77, 67; 96, 18] 48,63 [38, 8; 70, 1] Удельная плотность нейронов, % 38,89 [31, 47; 42, 2] 27,82 [21, 15; 33, 47] ***p < 0,001 - различия достоверны по сравнению с контрольной группой, **р < 0,01 - различия достоверны по сравнению с контрольной группой; *р < 0,05 - различия достоверны по сравнению с контрольной группой (использован критерий Манна-Уитни). Таблица 2 Изменение уровня экспрессии белков теплового шока HSP 70 и HSP90 в нейронах пирамидного слоя гиппокампа Параметр Группа 1 (контроль) Группа 2 (гипертензивная энцефалопатия) СА1 УК HSP70-позитив-ных нейронов, % 48,1 51 УК HSP90-позитив-ных нейронов, % 38,8 41,2 СА2 УК HSP70-позитив-ных нейронов, % 33,2 41,6 УК HSP90-позитив-ных нейронов, % 29,6 30,1 СА3 УК HSP70-позитив-ных нейронов, % 33,1 47,1 УК HSP90-позитив-ных нейронов, % 30,6 31,1 СА4 УК HSP70-позитив-ных нейронов, % 41,4 46,5 УК HSP90-позитив-ных нейронов, % 31,2 33,1 **р < 0,01 - различия достоверны по сравнению с контрольной группой; р < 0,05 - различия достоверны по сравнению с контрольной группой (использован критерий Манна-Уитни). При экспериментальной гипертензивной энцефалопатии было отмечено увеличение УК гиперх-ромных нейронов во всех зонах гиппокампа, которые рассматриваются как поврежденные клетки [2, 8]. Кроме того, было отмечено снижение УП нейронов пирамидного слоя гиппокампа во всех зонах по сравнению с контрольной группой, что свидетельствует об активации процессов клеточной смерти за счет апоптоза или подобных механизмов гибели нейронов [10, 11] (рис.). Наиболее выраженные признаки обратимых и необратимых патогистологических изменений наблюдались в левом гиппокампе, что, по-видимому, связано с неравномерностью кровенаполнения, отеком, гипоксией при гравитационном воздействии в каудо-краниальном векторе с учетом направления углового ускорения и Выпуск 4 (60). 2016 93 ІШторСз Рис. Зона СА3 гиппокампа крысы с моделируемой в гипертензивной энцефалопатией (А), зона СА1 крысы с моделируемой гипертензивной энцефалопатией (Б), Иммуногистохимическое исследование, антитела против HSP 70, докраска гематоксилином. Ув. Х 400 согласуется с работами, описывающими асимметрию повреждения структур головного мозга при гипоксичес-ком повреждении [11]. При оценке результатов иммуногистохимического исследования выявлено увеличение УК HSP 70 - позитивных нейронов во всех зонах пирамидного слоя гиппокампа, а также отмечено усиление экспрессии HSP 90 в СА1 гиппокампа животных с моделируемой гипертензивной энцефалопатией. Поскольку повышение экспрессии белков HSP 70 и HSP 90 в клетках связано с их цитопротекторными функциями [8, 13], важной ролью в регуляции фолдинга белков, процессов аутофа-гии и выживании клеток при гипоксическом повреждении, выявленная гиперэкспрессия белков теплового шока, преимущественно в нейронах пирамидного слоя гиппокампа рассматривается нами как косвенный признак включения молекулярных адаптационных механизмов при моделировании гипертензивной энцефалопатии в перикарионах и отростках нейронов, что способствует выживанию клеток. Более выраженная экспрессия HSP 70 во всех зонах гиппокампа по сравнению с HSP 90 свидетельствует, по-видимому, о меньшей роли HSP 90 в клеточной выживаемости при данной модели гипертензивной энцефалопатии. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, данная модель гипертензивной энцефалопатии приводит к появлению признаков обратимого и необратимого повреждения в нейронах пирамидного слоя гиппокампа во всех зонах, которые сопровождаются активацией адаптационных механизмов и подтверждаются усилением экспрессии HSP 70 во всех зонах, а также усилением экспрессии HSP 90 в зоне СА1. ЛИТЕРАТУРА

About the authors

A. V. Smirnov

Volgograd State Medical University; Volgograd Medical Research Center

M. V. Schmidt

Volgograd State Medical University; Volgograd Medical Research Center

D. S. Mednikov

Volgograd State Medical University

Email: mednikov1988@gmail.com

M. R. Ekova

Volgograd State Medical University

I. N. Tyurenkov

Volgograd State Medical University

D. V. Kurkin

Volgograd State Medical University

E. V. Volotova

Volgograd State Medical University

References

Supplementary files