EXPERIMENTAL STUDY OF DOSE-DEPENDENT ENDOTHELIOTROPIC EFFECT OF ATACL IN ISCHEMIC BRAIN DAMAGE IN RATS

全文:

Нарушения мозгового кровообращения, в частности инсульт, на сегодняшний день, представляют огромную медико-социальную проблему [3]. Несмотря на существенные успехи ангионеврологии в понимании основных механизмов развития нарушений церебральной гемодинамики число случаев смертельного исхода от инсульта неуклонно увеличивается. Немаловажен тот факт, что только 20 % пациентов, перенесших инсульт, могут вернуться к прежней деятельности, таким образом, риск инвалидизации с потерей трудоспособности в результате инсульта также высок [5, 8]. Изменить сложившуюся тенденцию можно путем рациональной и своевременной фармакотерапии нарушений мозгового кровообращения [5]. Одним из основных патогенетических механизмов повреждения головного мозга в результате инсульта является индукция окислительного стресса [8]. Генерация активных форм кислорода (АФК) вызывает повреждение функционально активных молекул, таких как липиды, белки и ДНК. При этом существенна окислительная модификация клеток сосудистого эндотелия, приводящая к развитию эндотелиальной дисфункции (ЭД) [11]. В условиях инсульта формирование ЭД приводит к ухудшению церебральной микроциркуляции, повышенному тромбообразованию, индукции воспаления и пролиферации сосудистой стенки, что усугубляет течение заболевания и снижает шансы на его благоприятный исход [2, 11]. Таким образом, коррекция ЭД может считаться одной из основных стратегий лекарствен ной терапии нарушения мозгового кровообращения [11]. С этой целью возможно применение соединений, обладающих антиоксидантными свойствами, но поскольку при применении антиоксидантов высок риск «обратной» реакции с интенсификацией процессов окисления [9], важным становится выбор оптимальной дозы для проведения рациональной терапии, что, в свою очередь, и определило цель настоящего исследования. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Изучить дозозависимое влияние соединения ATACL на состояние эндотелия сосудов в условиях ишемии головного мозга. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование выполнено на 80 крысах-самцах линии Wistar, рандомизированных по возрасту и массе (половозрелые, массой 220-240 г), разделенных на 8 равных экспериментальных групп по 10 особей в каждой. Первую группу составили ложнооперированные животные (Л/О). Второй (группа негативного контроля - НК) и последующим группам крыс моделировали фокальную ишемию головного мозга методом необратимой окклюзии правой средней мозговой артерии под местом ее пересечения с обонятельным трактом [1]. Группы животных с 3-й по 5-ю получали препараты сравнения: сулодексид (Вессел Дуэ Ф, Alfa Wasserman, Италия), в дозе 30 ЕВЛ [4] (единицы высвобождения липопротеин-липазы), мексидол (ФАРМАСОФТ, Россия) - 54 Выпуск 1 (61). 2017 30 мг/кг [6], тиоктовая кислота (Октолипен, Фармстандарт-Лексредства, Россия) - 50 мг/кг [7]. Группы крыс с 6-й по 8-ю получали изучаемое соединение ATACL в трех вариантах дозирования: 50 мг/кг, 100 мг/кг и 200 мг/кг Исследуемое соединение и препараты сравнения вводились перорально в виде водной суспензии непосредственно после воспроизведения ишемии головного мозга и на протяжении 3 суток. По истечении указанного времени проводили оценку состояния вазодилатирующей функции эндотелия сосудов, агрегационной активности тромбоцитов, как составляющей его антитромботической функции, и мониторинг сывороточной концентрации С-реактивного белка (СРБ), как показателя, характеризующего противовоспалительную функцию сосудистого эндотелия. Вазомоторную функцию эндотелия сосудов оценивали по изменению средней систолической скорости (СК) локального мозгового кровотока на фоне внутривенного введения анализаторов эндотелиальной функции: ацетил-холин (АЦХ) 0,1 мг/кг (Sigma-Aldrich), L-аргинин 150 мг/кг (Panreac), нитрон-аргинин метиловый эфир (L-NAME) 15 мг/кг (Sigma-Aldrich). Эндотелий-независимую вазоди-латацию оценивали по изменению СК при введении нитроглицерина (НТГ) 0,007 мг/кг (Биомед, Россия). СК регистрировали в проекции правой средней мозговой артерии, с помощью ультразвукового допплерографа, датчика УЗ0П-010-01 с рабочей частотой 25 МГц и компьютерной программы ММ-Д-К-Minimax Doppler v.1.7. (Санкт-Петер бург Россия). Агрегационную активность тромбоцитов (степень агрегации) определяли на лазерном двухканальном анализаторе агрегации АЛАТ-2 БИОЛА (НПФ «БИОЛА», Россия). В качестве индуктора использовали АДФ (НПО «РЕНАМ», Россия) в конечной концентрации 5 мкМ. Концентрацию СРБ определяли методом латекс-агглютинации, с использованием набора реактивов Арбис+ (НПФ «Арбис+», Санкт-Петербург, Россия). Результаты опытов обрабатывали методом вариационной статистики с использованием пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 (StatSoft, Inc., США для операционной системы Windows). Полученные данные подвергались тесту на нормальность распределения с использованием критерия Шапиро-Уилка. В случае нормального распределения данных для сравнения средних использовали t-критерий Стьюдента. При ненормальном распределении результатов эксперимента дальнейшую статистическую обработку данных проводили с использованием U-критерия Манна-Уитни. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Исходная скорость локального мозгового кровотока у Л/О группы животных составляла (4,042 ± 0,217) см/с. На фоне фокальной ишемии головного мозга у крыс СК снизилась в 2,8 раза (p < 0,01) - группа животных негативного контроля. У крыс, получавших сулодексид, мексидол и тиоктовую кислоту, исходная скорость церебрального кровотока была ниже аналогичного значения у ложнооперированной группы крыс в 2,4 (p < 0,01) раза, 2,2 (p < 0,01) и 2,6 (p < 0,01) раза соответственно. На фоне введения соединения ATACL первоначальная СК для групп крыс, которым вводили 50 мг/кг, 100 мг/кг и 200 мг/кг, составляла соответственно (1,810 ± 0,159) см/с, (1,883 ± 0,327) см/с и (1,619 ± 0,259) см/с. Оценивая влияние различных доз соединения ATACL и препаратов сравнения на вазодилатирующую функцию эндотелия сосудов в условиях фокальной ишемии головного мозга у крыс установлено, что у ложнооперирован-ных животных скорость локального мозгового кровотока в ответ на введение АЦХ повышается на 48,7 % (p < 0,01) (рис. 1). Внутривенное введение L-аргинина данной группе крыс не вызвало существенных изменений церебральной гемодинамики, в то время как в ответ на введение L-NAME СК у Л/О животных уменьшилась на 33,7 % (p < 0,05). При этом следует отметить, что эндотелий-не-зависимая вазодилатация, опосредованная введением НТГ, была сопоставима во всех экспериментальных группах (рис. 1) (скорость мозгового кровотока изменялась практически в равной степени). *Статистически значимо (f-критерий Стьюдента) относительно исходной скорости кровотока (p < 0,01); Статистически значимо (f-критерий Стьюдента) относительно исходной скорости кровотока (p < 0,05). Рис. 1. Изменение вазодилатирующей функции эндотелия сосудов под влиянием различных доз соединения ATACL на фоне фокальной ишемии головного мозга Выпуск 1 (61). 2017 55 ЩШгорСз На фоне фокальной ишемии головного мозга у группы крыс негативного контроля наблюдалось угнетение вазомоторной функции эндотелия сосудов, что подтверждается сниженной реакцией на введение АЦХ и L-NAME у данной группы животных, по сравнению с Л/О группой крыс (увеличение СК и ее падение составили 12,3 % и 9.3 % (рис. 1) соответственно). Также у НК группы животных отмечено значительное (на 35,9 %, p < 0,05) увеличение скорости мозгового кровотока при введении L-аргинина, что свидетельствует о развитии у данной группы животных феномена «L-аргининового парадокса», что подтверждается ранее проведенными исследованиями [1]. На фоне применения мексидола и тиоктовой кислоты скорость церебрального кровотока при введении АЦХ увеличилась соответственно на 22,3 % (p < 0,05) и 21,4 % (p < 0,05). В ответ на введение L-аргинина у крыс, получавших мексидол, СК увеличилась на 24,6 % (p < 0,05), а у животных, которым вводили тиоктовую кислоту, - на 20,9 % (p < 0,05). При внутривенном введении L-NAME скорость локального мозгового кровотока снизилась на 14,6 % (мексидол) и 16,6 % (тиоктовая кислота). У крыс, получавших сулодексид, СК в ответ на внутривенное введение АЦХ увеличилась на 28,9 % (p < 0,05), а при введении L-NAME снизилась на 25,8 % (p < 0,05). При введении донатора NO-L-аргинина скорость церебрального кровотока у животных, получавших сулодексид, увеличилась всего на 17,4 %, что было ниже аналогичного значения НК группы крыс на 106.3 % (p < 0,05) (рис. 1). Полученные в ходе выполнения исследования данные подтверждаются ранее проведенными исследованиями, посвященными эндо-телипротекторным свойствам мексидола, тиоктовой кислоты и сулодексида [2, 4, 6, 7]. Анализируя данные, полученные при коррекции ишемии головного мозга введением соединения ATACL, установлено, что наиболее выраженное воздействие на вазодилатирующую функцию эндотелия сосудов данное соединение оказало в дозе 100 мг/кг. При этом реакция сосудов (дилатация) в ответ на введение АЦХ при применении ATACL в дозе 100 мг/кг увеличивала СК на 30,9 % (p < 0,05). В то же время применение ATACL в дозах 50 мг/кг и 200 мг/кг приводило к меньшему сосудистому ответу на введение АЦХ (скорость кровотока увеличилась на 18,9 % и 24,4 % (p < 0,05) соответственно). На фоне введения L-аргинина СК увеличилась на 24,9 % (p < 0,05) и 25,9 % (p < 0,05) соответственно при применении ATACL в дозах 50 мг/кг и 200 мг/кг, в то время как скорость церебрального кровотока при введении L-аргинина крысам, получавшим ATACL в дозе 100 мг/кг, увеличилась лишь на 16,2 % (рис. 1). Блокада синтеза оксида азота, посредством введения L-NAME животным, получавшим ATACL в дозах 50 мг/кг, 100 мг/кг и 200 мг/кг, привело к падению СК на 12,8 %, 24,9 % (p < 0,05) и 16,7 % соответственно. Анализ агрегационной активности тромбоцитов показал, что степень АДФ-индуцированой агрегации тромбоцитов у Л/О группы крыс составляла (1,345 ± 0,114) усл. ед. (рис. 2). Фокальная ишемия головного мозга способствовала увеличению данного показателя у группы крыс негативного контроля, по сравнению с Л/О животными, на 97,4 % (p < 0,05). Применение мексидола и тиоктовой кислоты, на фоне ишемического повреждения головного мозга, привело к снижению степени агрегации тромбоцитов относительно НК группы крыс на 30,5 % (p < 0,05) и 25,7 % соответственно (рис. 2). На фоне применения сулодексида степень агрегации кровяных пластинок по отношению к группе животных негативного контроля уменьшилась на 52,5 % (p < 0,05). Полученные данные согласуются с литературными источниками [2]. При введении соединения ATACL в дозах 50 мг/кг, 100 мг/кг и 200 мг/кг степень АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов уменьшилась (по сравнению с группой животных негативного контроля) на 27,8 %, 33,3 % (p < 0,05) и 56,4 % (p < 0,05) (рис. 2) соответственно. Таким образом, соединение ATACL в дозе 100 мг/кг способствовало уменьшению агрегационного потенциала тромбоцитов практически в одинаковой степени с сулодексидом. Концентрация С-реактивного белка у группы ложно-оперированных животных составляла (2,1 ± 0,215) мг/л. (рис. 3). На фоне ишемии головного мозга отмечено увеличение данного показателя в 7,8 раза (p < 0,05). *Статистически значимо (U-критерий Манна-Уитни) относительно группы животных негативного контроля (p < 0,05). Рис. 2. Изменение агрегационной активности тромбоцитов на фоне введения различных доз соединения ATACL при фокальной ишемии головного мозга 56 Выпуск 1 (61). 2017 *Статистически значимо (t-критерий Стьюдента) относительно группы животных негативного контроля (p < 0,05). Рис. 3. Влияние различных доз соединения ATACL на концентрацию С-реактивного белка в условиях фокальной ишемии головного мозга Применение мексидола, тиоктовой кислоты и су-лодексида способствовало снижению концентрации СРБ, по сравнению с группой животных негативного контроля, на 31,2 % (p < 0,05), 12,3 % и 90,7 % (p < 0,05) соответственно. Применение соединения ATACL в дозах 50 мг/кг и 200 мг/кг способствовало снижению концентрации СРБ, по сравнению с НК группой животных на 51,9 % (p < 0,05) и 41,4 % (p < 0,05) соответственно. Введение ATACL в дозе 100 мг/кг привело к уменьшению содержания С-реактивного белка, в сравнении с группой крыс негативного контроля, на 107,6 % (p < 0,05). Изменения в вазодилатационной функции эндотелия сосудов, агрегационной активности тромбоцитов и концентрации СРБ при применении соединения ATACL, вероятно, связаны с антиоксидантными свойствами данного соединения. Являясь производным гидроксикорич-ной кислоты, ATACL, выступая в качестве «скэвендже-ра» свободных радикалов, возможно, способствует нивелированию одного из ведущих патогенетических звеньев в цепи «ишемического каскада» - окислительного стресса [2]. В результате, по всей вероятности, снижается окислительная модификация клеточных структур (индуцируемая активными формами кислорода), в том числе и эндотелиоцитов сосудов, что, в свою очередь, может способствовать нормализации эндоте-лий-зависимой продукции вазоактивных соединений (вазодилататоров, антиагрегантов и антивоспалитель-ных агентов, например, NO), восстанавливая тем самым нарушенную эндотелиальную функцию. Дозозависимый эффект соединения ATACL может быть объяснен «параболическим» характером действия антиоксидантов. В определенных условиях (например, введение неадекватной клиническому случаю дозы) антиоксидантный эффект сменяется прооксидантным, с интенсификацией клеточного повреждения, что ведет к уменьшению терапевтической эффективности применяемого антиоксиданта [10-12]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 1. Фокальная ишемия головного мозга приводит к угнетению вазомоторной функции эндотелия сосудов [отмечено снижение вазореактивности к ацетилхолину и L-NAME (увеличение и соответственно уменьшение скорости кровотока в ответ на введение данных анализаторов составило всего 12,3 % и 9,3 %, развитие феномена «L-аргининового парадокса»-увеличение СК на фоне введения L-аргинина от ее исходного уровня на 35,9 %, p < 0,05)], инициации синдрома гиперагрегации (повышение степени агрегации тромбоцитов на 97,4 %, p < 0,05) и активации процессов воспаления (увеличение концентрации С-реактивного белка в 7,8 раз, p < 0,05). 2. Применение мексидола, тиоктовой кислоты и сулодексида позволило скорректировать возникшие изменения. Причем введение мексидола оказало более значимое действие на агрегационный потенциал тромбоцитов и содержание С-реактивного белка, тиоктовой кислоты - на состояние вазомоторной функции сосудистого эндотелия. Применение сулодексида способствовало нормализации всех изучаемых параметров. 3. Соединение ATACL оказало дозозависимый эндотелийпозитивный эффект. Введение данного соединения в дозе 50 мг/кг не оказало существенного влияния на изучаемые параметры (за исключением концентрации СРБ - отмечено ее снижение на 51,9 %, p < 0,05). Применение ATACL в дозе 200 мг/кг способствовало восстановлению вазомоторной функции эндотелия, снижению степени агрегации тромбоцитов и концентрации С-реактивного белка. При этом эффект от применения данной дозы ATACL был сопоставим с таковым у мексидола и тиоктовой кислоты и уступал сулодексиду. Введение ATACL в дозе 100 мг/кг привело к нормализации всех изучаемых параметров, причем по степени эндотелийпозитивного воздействия соединение ATACL в дозе 100 мг/кг превосходило мексидол и тиоктовую кислоту и было сопоставимо ссулодексидом. Выпуск 1 (61). 2017

作者简介

A. Voronkov

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute, Affiliate of the Federal State-Funded Educational Establishment of Higher Education «Volgograd State Medical University»

E. Oganesyan

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute, Affiliate of the Federal State-Funded Educational Establishment of Higher Education «Volgograd State Medical University»

D. Pozdnyakov

Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute, Affiliate of the Federal State-Funded Educational Establishment of Higher Education «Volgograd State Medical University»

Email: pozdniackow.dmitry@yandex.ru

V. Abaev

The K.L. Khetagurov North Ossetian State University

参考

补充文件