EXPRESSION OF SERINE RACEMASE IN THE HIPPOCAMPUS OF RATS IN THE MODEL OF CHRONIC CEREBRAL BLOOD-FLOW DISORDERS

Full Text

Хронические нарушения мозгового кровообращения (ХНМК) представляют собой важную проблему фундаментальной и практической медицины. Тенденция к увеличению в структуре цереброваскулярной патологии форм с хроническим течением, а также тяжесть, зачастую необратимость последствий хронических расстройств мозгового кровотока, обуславливают их высокую медико-социальную значимость [1, 2]. Наиболее важными факторами, приводящими к расстройствам церебральной гемодинамики, выступают атеросклеротическая болезнь и артериальная гипертензия (АГ), встречаемость которых остается высокой как в России, так и в мире [2, 3]. Частый исход в дисциркуляторную энцефалопатию и деменцию обусловливается медленно нарастающими очаговыми и диффузными изменениями головного мозга [3]. Гиппокамп, как часть «эмоционального мозга», осуществляет формирование и регуляцию поведенческих реакций, эмоционального статуса, обеспечивает пространственное ориентирование, вовлечен в механизмы памяти [4, 6]. В то же время гиппокамп является одной из наиболее уязвимых структур головного мозга при нарушениях мозгового кровообращения [5, 6]. Несмотря на значительные успехи в изучении закономерностей развития и протекания ХНМК, многие патогенетические аспекты этих заболеваний остаются на сегодняшний день малоизученными. В частности, перспективным направлением в изучении патоморфоза ХНМК является исследование феномена эксайтотоксичности. Эксайтотоксичность представляет собой универсальный механизм вторичного повреждения и гибели нейронов при нейродегене-ративных заболеваниях, острых и хронических формах ишемии головного мозга, при травмах центральной нервной системы (ЦНС) и связана с избытком или нарушенным обратным захватом возбуждающих нейро Выпуск 2 (62). 2017 47 ЩШгорСз [ЩшйТПМЩ трансмиттеров [11]. Важнейшим среди возбуждающих медиаторов в ЦНС считается глутамат, осуществляющий специфическую постсинаптическую нейротрансмиссию [9]. Избыточное влияние глутамата на рецепторный аппарат, в частности, NMDA-рецепторы, опосредует каскад биохимических изменений, ведущий к развитию внутриклеточного ацидоза, накоплению свободного внутриклеточного кальция и активации ряда ферментов с образованием свободных радикалов. Кроме того, NMDA-опосредованная эксайтотоксичность ведет к активации потенциальных внутриклеточных посредников, например, оксида азота [9, 11]. D-серин выступает в роли ко-агониста NMDA-рецепторов и в нормальных условиях вовлечен в процессы обучения и памяти [8, 12]. Однако во многих исследованиях предполагается его роль в глу-таматном повреждении при ряде заболеваний ЦНС [10, 12]. Образование D-серина в нейронах и глиальных клетках происходит с участием фермента сериновой раце-мазы (СР) из L-серина [12]. Увеличение содержание СР и продукта его ферментативной реакции - D-серина - рассматривается как предшествующий эксайтотоксич-ности процесс, а специфическое ингибирование этого фермента предложено рядом авторов в качестве многообещающего нейропротективного механизма [10]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Качественными и количественными методами морфологической оценки описать особенности экспрессии сериновой рацемазы в различных зонах гиппокампа. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Исследование проведено на половозрелых крысах линии Wistar (питомник «Рапполово»). Содержание животных соответствовало правилам лабораторной практики (GLP) и Приказу МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». При проведении экспериментов учитывались требования комиссии по проблеме этики отношения к животным Российского национального комитета по биоэтике при Российской академии наук; и этические нормы, признанные мировым сообществом, и изложенные в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных». Хронические нарушения мозгового кровообращения моделировались на бодрствующих 12-месячных крысах со среднеактивным типом поведения, которых помещали в пеналы, размещенные по краям горизонтальной штанги центрифуги в строго каудо-краниальном направлении и подвергали гравитационной перегрузке величиной 9 G в течение 5 минут дважды в день в течение 4 недель - 2-я группа (экспериментальная, n = 10). 1-ю группу составили крысы того же возраста без гравитационного воздействия (контроль, n = 10). На 29-е сутки животных выводили из эксперимента, получали образцы головного мозга с дальнейшим приготовлением гистологических препаратов по стандартной методике. Срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, тионином по методу Ниссля. Исследование микропрепаратов проводилось с помощью микроскопа «Axio Lab. A1 » (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Germany), фотодокументирование осуществляли камерой «AxioCam 105 color» (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Germany). Оценку степени повреждения проводили с помощью подсчета удельного количества (УК) нейронов с признаками повреждения (гиперхро-мия ядра и цитоплазмы, сморщивание перикариона), а также удельной плотности (УП) перикарионов нейронов пирамидного слоя. Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование проводили с применением моноклональных антител против сериновой рацемазы (СР) (1:50, Santa Cruz, Biotechnology, Inc.) с использованием полимерной системы (Thermo Scientific, Fremont, CA), качестве хромогена использовали DAB (диаминобензидин). Оценку степени экспресии проводили путем подсчета относительной площади (ОП) иммунореактивного материала (ИРМ) в пирамидном слое всех зон гиппокампа с помощью модуля Image Analysis программы ZEN 1.1.2.0 (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Germany). Статистическую обработку данных проводили с использованием пакетов программ MS Office Excell 2007 (Microsoft Inc., США), Statistica 6,0 (StatSoft, USA). Обобщенные данные представляли в виде медианы (Me) с указанием интерквартильного интервала [Q1 ;Q3], где Q1 - 25 процентиль, Q3 - 75 процентиль. Различия между группами оценивали по критерию Манна-Уитни (Mann-Whitney, U-test) и считали статистически значимыми при p < 0,05 [1]. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ При гистологическом исследовании СА1 зоны гиппокампа животных из группы с гравитационным воздействием в пирамидном слое обнаружено резкое увеличение числа нейронов с признаками повреждения. Пирамидные нейроны приобретали веретеновидную форму перикариона, отмечалась выраженная ядерная и цитоплазматическая гиперхромия, в клеточном составе пирамидного слоя отмечалось увеличение числа клеток-теней. Нарушение цитоархитектоники СА1 зоны проявлялось в менее компактном расположении пирамидных нейронов, возникающей по причине перицеллю-лярного и периваскулярного отека картине спонгиоза, а также приобретении отростками нейронов усиленной извитости. Менее плотное расположение тел нейронов в пирамидном слое и признаки повреждения, выявляемые визуально, подтверждались и морфометрическим методом - удельная плотность (УП) нейронов пирамидного слоя СА1 в экспериментальной группе снижалась на 20,6 % (p < 0,01), а удельное количество нейронов с признаками повреждения увеличилось на 59,7 % по сравнению с контролем. При ИГХ исследовании с использованием антител против сериновой рацемазы (СР) в контрольной группе преобладала цитоплазматическая экспрессия интенсивностью 2 балла, в отдельных нейронах выявлялась экспрессия, достигающая 3 балла (рис. 1). В группе крыс с гравитационным воз- 48 Выпуск 2 (62). 2017 ШЭэз'щшСз действием характер экспрессии сменялся на преимущественно выраженную (3 балла). Особенностью экспрессии СР в экспериментальной группе являлась транслокация иммунореактивного (ИРМ) материала, который определялся не только в цитоплазме перикарионов, но и в отростках пирамидных нейронов (рис.). Кроме того, участки экспрессии интенсивностью преимущественно 2 балла определялись и в глиальных клетках молекулярного и полиморфного слоев. При морфометрическом исследовании определялось увеличение относительной площади ИРМ в пирамидном слое на 5,5 % по сравнению с контролем (р < 0,05) (табл.). Для зоны СА2 гиппокампа крыс 2-й группы были характерны схожие с СА1 изменения, проявляющиеся прежде всего резким отеком, эритроцитарными стазами, полнокровием, а также плазматическим пропитыванием стенок сосудов микроциркуляторного русла. СА2 зона характеризовалась максимальным увеличением числа нейронов с признаками повреждения - на 68 % по сравнению с контрольной группой (р < 0,001). Морфометрически было выявлено снижение УП перикарионов нейронов пирамидного слоя на 14 % по сравнению с контролем (р < 0,01). При иммуногистохимическом ис следовании СР в СА2 зоне не обнаружено достоверных отличий в значениях относительной площади ИРМ от контрольной группы. При этом необходимо отметить, что ИРМ визуализировался в дендритных отростках пирамидных нейронов, что не наблюдалось в контроле. При исследовании СА3 зоны гиппокампа крыс 2-й группы обнаружен максимально выраженный пери-васкулярный и перицеллюлярный отек. В пирамидном слое преобладали нейроны с признаками повреждения вплоть до клеток-теней, со сморщенными перикарио-нами и извитыми отростками. УК нейронов с признаками повреждения в СА3 увеличилось на 63,3 % по сравнению с контрольной группой (р < 0,05). УП перикарионов пирамидного слоя снизился во 2-й группе на 15,7 % (р < 0,01). При ИГХ исследовании с применением антител против СР в СА3 зоне крыс 2-й группы обнаружена равномерная цитоплазматическая экспрессия в пирамидных нейронах, причем, в отличие от контрольной группы, ИРМ выявлялся не только в перикарионах нейронов, но и в отростках, которые приобретали извитой вид. В СА3 зоне выявлена тенденция к уменьшению относительной площади ИРМ (табл.), однако, не наблюдалось изменений в интенсивности экспрессии. Рис. Иммуногистохимическое исследование зоны СА1 гиппокампа крыс с применением антител против сериновой рацемазы, докраска гематоксилином. Ув. Х 400. А - Контроль. Равномерное цитоплазматическое распределение ИРМ. Б - крысы, подвергавшиеся воздействию гипергравитации в течение 4 недель. Усиление интенсивности ИРМ, транслокация ИРМ в отростки пирамидных нейронов Относительная площадь иммунореактивного материала при исследовании гиппокампа крыс с применением антител против сериновой рацемазы Параметр Группа 1 (контроль) Г руппа 2 (гравитационное воздействие) СА1 ОП СР-позитивного материала, % 4,1 [3,2; 6,91 9,6 [8,3; 10,11 СА2 ОП СP-позитивного материала, % 7,7 [6,2; 8,91 7,4 [6,5; 8,91 (р > 0,05) СА3 ОП СP-позитивного материала, % 8,6 [7,3; 9,21 6,2 [4,7; 7,11 (р > 0,05) СА4 ОП СP-позитивного материала, % 16,1 [7,2;20,41 8,2 [5;9,11 (р > 0,05) *р < 0,05 - различия достоверны по сравнению с контрольной группой (использован критерий Манна-Уитни). Выпуск 2 (62). 2017 49 ЩШгорСз [ЩшйТПМЩ При гистологическом исследовании зоны СА4 гиппокампа крыс 2-й группы выявлены значительные изменения клеточного состава пирамидного слоя. Преобладали нейроны с признаками повреждения, большинство из которых составляли клетки-тени со сморщенными перикарионами, приобретавшими веретеновидную или близкую к веретеновидной форму. Как и в остальных зонах, в СА4 гиппокампа крыс 2-й группы отмечены выраженные нарушения кровообращения в сосудах микроциркуляторного русла: резкое полнокровие, стазы и диапедез эритроцитов. Перицеллюлярный и пери-васулярный отек выявлялся не только в пирамидном слое, но и в молекулярном и краевом полиморфном слоях. При ИГХ исследовании с применением антител против СР выявлена явная тенденция к снижению уровня экспрессии ИРМ (табл.). В контрольной группе отмечалась резко позитивная цитоплазматическая реакция с интенсивностью ИРМ преимущественно 3 балла. В экспериментальной группе характер ИРМ сменялся на преимущественно умеренную, оценивавшуюся в 2 балла, в единичных клетках пирамидного слоя интенсивность достигала 3 балла. Следует отметить, что в контрольной группе животных уровень экспрессии СР был самым высоким в зоне СА4 как визуально по интенсивности реакции, так и подтверждался морфометрически самыми высокими значениями относительной площади ИРМ. Обнаруженные при морфологическом исследовании гиппокампа признаки нарушения кровообращения (резкий перицеллюлярный и периваскулярный отек, полнокровие и плазматическое пропитывание стенок капилляров, диапедез эритроцитов), а также выраженное увеличение числа нейронов с признаками повреждения во всех зонах свидетельствуют о глубоких дегенеративных изменениях и развитии как обратимого, так и необратимого повреждения при длительном воздействии гипергравитации. Развитие атрофических процессов подтверждается морфометрически достоверным снижением удельной плотности перикарионов во всех зонах гиппокампа, что свидетельствует о включении процессов клеточной гибели с возможным участием апоптоза. Наблюдаемые нами структурные изменения в гиппокампе соответствуют изменениям, описанным на различных моделях хронических форм цереброваскулярных болезней, на основании чего длительное гравитационное воздействие может быть предложено в качестве универсальной модели хронических нарушений мозгового кровообращения. Выявленные нами особенности экспрессии СР в гиппокампе крыс при моделировании хронических нарушений мозгового кровообращения прежде всего заключались ЛИТЕРАТУРА

About the authors

A. V. Smirnov

Volgograd State Medical University

Department of Pathological Anatomy, Department of Pharmacology and Biopharmacy, Department of Continuing Education

D. S. Mednikov

Volgograd State Medical University

Email: mednikov1988@gmail.com
Department of Pathological Anatomy, Department of Pharmacology and Biopharmacy, Department of Continuing Education

M. V. Schmidt

Volgograd State Medical University

Department of Pathological Anatomy, Department of Pharmacology and Biopharmacy, Department of Continuing Education

I. N. Tyurenkov

Volgograd State Medical University

Department of Pathological Anatomy, Department of Pharmacology and Biopharmacy, Department of Continuing Education

D. A. Bakulin

Volgograd State Medical University

Department of Pathological Anatomy, Department of Pharmacology and Biopharmacy, Department of Continuing Education

D. V. Kurkin

Volgograd State Medical University

Department of Pathological Anatomy, Department of Pharmacology and Biopharmacy, Department of Continuing Education

E. V. Volotova

Volgograd State Medical University

Department of Pathological Anatomy, Department of Pharmacology and Biopharmacy, Department of Continuing Education

References

Supplementary files