ALTERATION OF PHENOTYPIC CHARACTERISTICS OF BURKHOLDERIA PSEUDOMALLEI DURING INTERACTION WITH TETRAHYMENA PYRIFORMIS

Full Text

Burkholderia pseudomallei, Tetrahymena pyriformis, passaging, phenotypic characteristics. Возбудитель мелиоидоза, Burkholderia pseudomallei- сапрофитный микроорганизм, обитающий в почве и воде эндемичных регионов Юго-Восточной Азии, Северной Австралии, южного Китая [2]. Некоторые исследователи предполагают, что выживание его во внешней среде может быть связано со способностью перси-стировать в биотических объектах, таких как Acantamoeba spp., в ассоциации с которыми внутриклеточно локализованные буркхольдерии оказываются более защищенными от экстремальных воздействий среды [4]. На примере ряда патогенных микроорганизмов показано, что в клетках простейших, амеб или тетрахи-мен, интернированные микроорганизмы в процессе адаптационной изменчивости приобретают повышенную резистентность к факторам окружающей среды и частично утрачивают свойства, необходимые для выживания в макроорганизме [1, 3]. Природная способность возбудителя мелиоидоза к существованию как в сапрофитической, так и паразитической фазах является свидетельством высокого потенциала адаптационных возможностей, что находит подтверждение в структуре его генома [8]. Однако характер и механизмы изменчивости B. pseudomallei во внешней среде, в том числе, обусловленные взаимодействием с простейшими, мало изучены. В настоящей работе, используя приемы, описанные для других микроорганизмов, мы осуществили совместное культивирование B. pseudomalleb цилиарной инфузорией Tetrahymena pyriformis, убиквитарным обитателем водных экосистем, и исследовали в процессе их взаимодействия некоторые известные фенотипические свойства микроорганизма. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Изучить свойства буркхольдерий после пассажа в клетках T. pyriformis и выявить возможные отличия от фенотипа культур, выделенных от экспериментальных животных. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Были использованы дикий штамм B. pseudomallei 110, вирулентный для мышей линии BALB/c 0_0501х103м. к.), а также пуринзависимый ауксотрофный авирулентный мутант VPA (_D50 > 1х109м. к.). Аксеническая культура T pyriformis получена из Института Цитологии РАМН (г. Санкт-Петербург). Тетрахимены выращивали в Luria-Bertani (LB) бульоне (HiMedia) при температуре 28 оС. Буркхольдерии, выращенные на агаре LB при 32 оС 24 ч, суспендировали в стерилизованной авто-клавированием речной воде и соединяли с тетрахиме-нами в соотношении 100:1 (1х106 м. к./мл бактерий и 1 х104 кл/мл тетрахимен) в LB бульоне. Сокультуры микроорганизма и тетрахимен инкубировали в климатической камере («Sanyo», Япония) при температуре 28 оС на протяжении срока наблюдения (до 10суток). Для определения динамики размножения культур B. pseudomallei, ассоциированных с T pyriformis, из со-культур ежедневно производили высев на плотную питательную среду _Bагар для подсчета выросших колоний. Наличие внутриклеточной локализации микроорганизма в простейших определяли, используя метод, предложенный в работе Inglisetal [5]. Для осуществления пассажа B. pseudomallei в клетках тетрахимен образцы сокультур отбирали 44 Выпуск 2 (66). 2018 ©зеторСз [DOCKT спустя трое суток от начала совместного культивирования; материал осаждали центрифугированием при 8000 об./мин, 10 мин, отмывали в свежей среде LB и соединяли с проверенной на аксеничность культурой тетрахимен. Активность внеклеточных ферментов определяли на плотных питательных средах, содержащих необходимые субстраты: 1 %-й раствор «Skimmilk» («HiMedia», США), лецитин (100 мг на 100 мл среды), гемолизированную кровь (5%-ю) при определении протеазной, лецитиназной, генолитической активности соответственно. Подвижность тестировали на среде Motility («HiMedia», США) с добавлением 1 %-го ТТХ (трифенилтетразолия хлорида). Вирулентность буркхольдерий определяли на мышах линии BALB/c при внутрибрюшинном заражении 24 ч культурами B. pseudomallei в дозах 1х103 -1х104 м.к. и оценивали ее по динамике гибели животных в группах. При статистической обработке полученных данных применяли методы определения средних величин и доверительных границ к ним p < 0,05). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Известно, что взаимодействие различных патогенных микроорганизмов с T. pyriformis, сопровождается образованием в клетках простейших фагоцитарных вакуолей, содержащих поглощенные бактерии. При этом значительная часть интернированных бактерий в вакуолях тетрахимен подвергается лизису, но оставшиеся резистентные к фагоцитозу микроорганизмы могут размножаться в них [6, 7]. Для установления способности B. pseudomallei размножаться в клетках T pyriformis определяли динамику роста буркхольдерий в сокультурах и параллельно в LB без простейших (рис. 1). Как показано на рис. 1, в ассоциированных культурах в первые 24 ч отмечалось выраженное уменьшение количества бактерий (на 2 порядка), а затем восстановление его до исходного уровня, свидетельствующее о размножении микроорганизмов, выживших в фагосомах. ••• В. pseudomailei VPA (культура) - ß. pseudomailei VPA (сокультура) --В. pseudomallei 110 (культура) I- В. pseudomallei 110 (сокультура) Время (сутки) B. Pseudomallei VPA (до n х 105м.к./мл) и относительное быстрым, за тот же период времени, нарастание и уменьшение концентрации бактерий вирулентного штамма B. Pseudomallei 110 (до n х 104м. к./мл). Дополнительные данные о внутриклеточной локализации размножающихся интернированных буркхоль-дерий были получены при исследовании чувствительности к антибактериальным препаратам сокультур микроорганизма с тетрахименами в сравнении с культурами в LB. Определение минимальных бактерицидных концентраций (МБК) для B. Pseudomallei цефтазидима, док-сициклина, меропенема показало, что ассоциированные с тетрахименами культуры отличались повышенной резистентностью к этим антибиотикам, что являлось результатом ограниченного проникновения антибактериальных препаратов в эукариотические клетки (рис. 2). Рис. 2. Чувствительность к антибиотикам B. Pseudomallei 110 в сокультуре с T. pyriformis При выборе режима пассажа B. Pseudomallei 110 в T Pyriformis основывались на данных динамики размножения его культур в клетках тетрахимен.Исследованию подвергали культуры, выделенные из клеток тетрахимен после 15 пассажей: их высевали на различные селективные среды для определения продукции внеклеточно (декретируемых ферментов (протеаз, леци-тиназы, гемолизинов), а также подвижности (табл.). Активность внеклеточных ферментов B. Pseudomallei Штамм Диаметр зоны, мм 24 ч 48 ч Exp Lec Hem Exp Lec Hem Mot B. pseudomallei 110 исх. 2 2 <1 10 4 2 15 B. pseudomallei 110з.х. 4 2 <2* 14 4 2* 20 B. pseudomallei 110 Т.р. 6 4 <2 18 8 2 25 B. pseudomallei 110 з.х.+Т.р. 6 4 <2 10 8 2 25 B. pseudomallei 110 LB 2 2 <1 10 4 2 15 Рис. 1. Динамика размножения B. pseudomallei в сокультуре с T. Pyriformis Кривые роста культур в ассоциации с T pyriformis имели отчетливые различия, зависящие от штамма. Более медленным было увеличение и снижение концентрации клеток авирулентного штамма *ß-гемолитическая активность. Примечание: B. Pseudomallei 110 исх.- исходная культура; B. Pseudomallei 110 з.х. - культура от золотистых хомячков; 110 T.p. - после пассажа в T. pyriformis; 110 з.х. + Т.р. - от золотистых хомячков после пассажа в T. pyriformis; 110 LB - после пассажа в LB; Exp - экзопротеаза, Lec - лецитиназа, Hem - гемолизин, Mot - подвижность. Выпуск 2 (66). 2018 45 ІШторСз Как видно из табл., показатели активности внеклеточных ферментов и подвижность исходной культуры B. Pseudomallei 110 и культуры после пассажа в LB не имели отличий. Максимально выраженной протеазной, ле-цитиназной активностью и подвижностью обладали культуры, выделенные из клеток тетрахимен. Характерной особенностью культур, полученных от золотистых хомячков, было увеличение, в сравнении с исходной культурой, функции протеаз и подвижности, а также наличие ß-гемо-литической активности. Однако после пассажа в клетках тетрахимен культур, выделенных от животных, наблюдали исчезновение ß-гемолитической активности и формирование вокруг колоний зоны неполного гемолиза. Вирулентность культур, выделенных из клеток T. pyriformis, представлена на рис. 3. Рис. 3. Время гибели мышей линии BALB/c, зараженных культурой B. pseudomallei 110 в дозе 1 X 104 м.к., пассированной в клетках T pyriformis Показано, что после пассажа в тетрахименах культура не вызывала гибели мышей линии BALB/c в течение срока наблюдения (30 дней), в то время как исходный штамм B. Pseudomallei 110 приводил к гибели животных на 5-6-е сутки (рис. 3). ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, как следует из приведенных материалов, возбудитель мелиоидоза может выживать и размножаться в клетках простейших вида T. pyriformis. Пассаж в клетках тетрахимен оказывает влияние на фенотипические свойства B. pseudomallei, способствуя увеличению подвижности, продукции внеклеточно секретируемых ферментов (протеаз, лецитиназы). Одновременно с этим в результате пассажа в простейших нивелируется приобретенная в организме экспериментальных животных способность к ß-гемолитической активности и снижается вирулентность для экспериментальных животных. ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

About the authors

E. V Korol

FPHI «Volgograd Research Anti-Plague Institute» of Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare

Email: vari2@sprint-v.com.ru

L. K Merinova

FPHI «Volgograd Research Anti-Plague Institute» of Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare

N. G Plekhanova

FPHI «Volgograd Research Anti-Plague Institute» of Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare

O. A Merinova

FPHI «Volgograd Research Anti-Plague Institute» of Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare

E. V Shubnikova

FPHI «Volgograd Research Anti-Plague Institute» of Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare

T. V Senina

FPHI «Volgograd Research Anti-Plague Institute» of Federal Service for Supervision of Consumer Rights Protection and Human Welfare

References

Supplementary files