THE RATIONALE FOR SELECTION THE METHODS FOR THE RESEARCH OF THE LEVEL OF SELENIUM CONTENT IN THE MOUTHLOID LIQUID IN PERSONS WITH CHRONIC GENERALIZED PARODONTITIS

Full Text

Selenium, methods of determination, salivadiagnostics, periodontitis. Открытие селена связано с именами двух шведских ученых И. Берцелиусом и Г. Ганном, исследовавших в 1817 г. осадки, образовавшиеся в свинцовой камере при производстве серной кислоты. В настоящее время эссенциальная роль этого элемента для всего живого доказана как отечественными, так и зарубежными учеными [4, 12, 35]. Значение селена очень велико, поскольку он необходим для нормальной жизнедеятельности всего организма [4, 12]. Этот микроэлемент входит в состав селенопротеинов, важных антиоксидантных ферментов, которые препятствуют повреждению клеток свободными радикалами [20, 28, 31]. Главным антиок-сидантным селенозависимым ферментом является глу-татионпероксидаза, она способна разлагать токсичную перекись водорода до двух молекул воды [23], а ее активность имеет прямую зависимость от содержания селена в крови [33]. Селенопротеиды принимают участие в работе щитовидной железы, оказывают влияние на иммунную систему. Кроме того, селен способствует выведению тяжелых металлов [3, 31]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Проанализировать методы исследования уровня содержания селена в ротовой жидкости у лиц с хроническим генерализованным пародонтитом. По данным литературы, в организме человека селен содержится в количестве 10-20 мг [4]. Основная масса селена (около 80 %) находится в виде селеноци-стеина, причем селен в данном соединении находится в практически полностью ионизированном виде, что обуславливает его чрезвычайно эффективную каталитическую активность [8]. В организме человека селен накапливается в печени и почках. Его содержание в крови находится в пределах 0,001-0,004 ммоль/л [3]. Согласно данным литературы, до 80 °% населения России имеет недостаточную обеспеченность селеном [23, 24]. При дефиците селена у детей нарушаются процессы роста, снижается иммунитет, развиваются дерматиты и экземы [12]. Недостаток селена существенно повышает риск развития онкологических заболеваний, негативно влияет на функцию щитовидной железы, что, в свою Выпуск 3 (67). 2018 13 ЩШгорСз [ЩсмеТКЩ очередь, становится причиной нарушения всех видов обмена веществ в организме человека. На сегодняшний день доказано, что потребление селена снижает риск развития заболеваний органов кровообращения, онкопатологии и способствует увеличению продолжительности жизни [3]. Еще в 1996 г. в работе Clark L.C. c соавторами была продемонстрирована противоопухолевая активность селена [29]. В стоматологии c селен-дефицитными состояниями связано большое количество заболеваний зубов и пародонта [20, 10]. В свою очередь, множество биологических процессов в организме оказывают непосредственное влияние на структурно-пролиферативные процессы в тканях пародонта, чему посвящено значительное количество работ [14-19, 27]. Установление эссенциальной роли селена для жизнедеятельности организма человека стимулировало разработку и совершенствование аналитических методов его определения [5]. В основном интерес ученых был сосредоточен на определении содержания селена в окружающей среде, продуктах питания и т.д. Однако методы количественного и качественного определения селена постепенно нашли свое применение и в медицине. При этом большая часть работ, посвященных изучению содержания селена в организме человека в норме и при различных патологических состояниях, базируется на его определении в сыворотке крови, волосах и моче [5, 12, 26]. В последнее время интерес ученых всего мира вызывают возможности саливадиагностики. С каждым днем растет количество проведенных исследований, указывающих на ее перспективность [25]. Ротовая жидкость является сложным по составу биологическим материалом. Ее состав формируется из компонентов секретов крупных, малых и второстепенных слюнных желез, сальных желез и зубо-десневой жидкости [21], также в ее состав входят лейкоциты, десквамированные клетки эпителия, пищевой детрит и различные микроорганизмы. На состав ротовой жидкости оказывают влияние множество факторов: общее состояние организма человека, функциональная активность слюнных желез, вязкость слюны, состав пищи, гигиеническое состояние полости рта [23]. Тонкий структурный анализ ротовой жидкости играет важнейшую роль в диагностике, прогнозе, профилактике и лечении различных заболеваний, в том числе и воспалительных заболеваний пародонта. Современными исследованиями доказано наличие взаимосвязи между метаболическими показателями крови и ротовой жидкости при различных заболеваниях [9]. В настоящее время саливадиагностика считается признанной технологией для обнаружения в организме человека наркотиков, алкоголя, никотина, фармпрепаратов, онкомаркеров, ДНК, экзотоксинов [21]. В отличие от хорошо изученных рутинных методов анализа крови данный метод обладает бесспорными преимуществами. Наряду с высокой информа тивностью, его достоинствами является простой и безболезненный забор материала в требуемом количестве [6, 14, 25]. Кроме того, ротовая жидкость легко хранится [6]. На протяжении многих лет проблема определения селена в различных биологических средах не теряет своей актуальности. При определении данного микроэлемента в биоматериалах существуют трудности, связанные с ограничениями существующих методов измерения [11]. Несмотря на то, что предложено множество методик его определения в различных биологических средах, по сей день ученые не имеют единого мнения, какой способ наиболее оптимален для этих целей, а исследований, посвященных изучению содержания селена в ротовой жидкости при различных заболеваниях, практически нет. Согласно данным литературы, определить содержание селена можно, используя такие методы, как атомно-эмиссионный, атомно-абсорбционный, нейтронноактивационный, флуориметрический, фотометрический и масс-спектрометрический с индуктивно-связанной плазмой, инверсионно-вольтамперометрический, хроматографический и другие [5, 11]. Каждый из методов имеет свои ограничения, связанные в основном с нижним пределом обнаружения селена, селективностью, используемой аналитической аппаратурой, стоимостью необходимого оборудования [5]. Появление сообщения Д. Уоткинсона о применении 2,3-диаминонафтали-на, впервые описанного в 1962 г., способствовало появлению эффективного метода определения селена, который нашел широкое применение, в том числе и в медицине [11]. По мнению ряда авторов, определение селена посредством флуориметрического метода с 2,3-диами-нонафталином является наиболее приемлемым, поскольку он отличается высокой чувствительностью и специфичностью, не требует дорогостоящего и сложного оборудования. Предел обнаружения селена с его использованием составляет 8*10-1-8*10-8 %. Флуоримет-рический метод применяется для исследования содержания селена в различных биологических средах, продуктах питания, почвах и так далее [5]. Флуориметрический метод определения селена включает три стадии: мокрое сжигание органической части образца окислительной смесью с помощью азотной и хлорной кислот при высокой температуре, восстановление селена (VI) до селена (IV) соляной кислотой при нагревании и конденсацию селенистой кислоты с ДАН, в результате которой образуется 4,5-пиазоселе-нола, интенсивность флуоресценции которого пропорциональна содержанию селена в пробе [5]. Применение флуориметрического метода сопряжено с такими трудностями, как окисление реагента 2,3-диаминонафталина и мешающим влиянием матричных компонентов [11]. К существенным недостаткам данного метода определения селена относится необходимость строгого соблюдения оптимальных условий, 14 Выпуск 3 (67). 2018 полноты окисления органической части образца и устранения влияния других элементов [2]. Учеными предложены различные модификации данного метода определения селена с целью улучшения его чувствительности и повышения точности результатов. Так, в результате проведенных исследований Бутько З.Т. с соавторами был предложен модифицированный флуориметрический метод определения содержания селена в продуктах питания и биологических материалах с применением автоклавной минерализации образцов. В качестве окисляющей смеси автором использовалась концентрированная азотная кислота и 50%-я перекись водорода в соотношении 6:1. Было установлено, что оптимальными условиями реакции конденсации являются: рН растворов в диапазоне от 1,8 до 2,0; время - 30 мин, а в качестве органического растворителя 4,5-пиазоселенола - циклогексан [5]. Крыловой А.Н. с соавторами описан метод определения селена в биологическом материале с использованием дитизона. Данный метод обладает такой же чувствительностью (0,08 мкг/мл), как и методы с использованием диаминонафталина, диаминобензидина, но технически он проще и доступнее. Присутствие железа в количестве до 5 мг не мешает определению селена по дитизонату, а более высокое содержание железа (10 мг) завышает результаты до 6 %. Недостатком метода определения селена по дитизонату является высокая окисляемость дитизона, образующего продукты окисления, которые обладают близкими к дитизонату селена светопоглощением [13]. В процессе аналитических работ, проведенных Ермаковым В.В. и соавторами, было выявлено, что метод спектрфлуориметрии в сочетании с высокоэффективной жидкостной хроматографией имеет преимущества по сравнению с классическим исполнением данного метода [11]. С учетом сложностей при спектрфлуориметричес-ком определении селена в биоматериалах японскими учеными был предложен методический прием - применение спектрфлуориметрического варианта в сочетании с высокоэффективной жидкостной хроматографией [32]. Этот прием дает возможность отделить основное комплексное соединение селена от примесей, образующихся в процессе анализа. Также в исследовании Ермакова В.В.с соавторами показано, что определение селена методом атомноабсорбционной спектрометрии в сыворотки крови является более эффективным, чем при определении селена с помощью флуориметрического метода. В процессе измерений концентраций селена посредством атомноабсорбционной спектрометрии с термической атомиза-цией существенную роль играет модификатор матрицы. Как правило, хорошие результаты дает применение нитрата палладия. Подобные результаты получены автором и с нитратом никеля [11]. Газовая хроматография относится к числу хроматографических методов. Она достаточно редко приме няется в практике, и, как правило, ее использование ограничивается определением летучих форм селена. Газовая хроматография-масс-спектрометрия является одним из комбинированных методов количественного и качественного анализа широкого круга соединений. Этот метод сочетает в себе два мощных аналитических инструмента: газовую хроматографию, которая обеспечивает высокоэффективное разделение компонентов сложных смесей в газовой фазе, и масс-спектромет-рию, позволяющую идентифицировать все компоненты смеси. Еще в середине прошлого века были предложены различные варианты применения газового хроматографа в качестве системы разделения и ввода пробы в масс-спектрометр [36]. Газовая хроматография-масс-спектрометрия высокоспецифично характеризует вещества по газохроматографическим индексам удерживания и масс-спектрам. Вещества с перекрывающимися хроматографическими пиками различают по их масс-спектрам. С другой стороны, изомеры с похожими или идентичными масс-спектрами различают по индексам удерживания. Газовая хроматография и масс-спектрометрия дополняют друг друга при анализе смесей. Однако в клинической практике данный метод не получил широкого распространения [7]. В работе Иваненко Н.Б. с соавторами отмечено, что применение классических электрохимических и фотометрических детекторов при хроматографическом или электрофоретическом определении форм микроэлементов ограничено [12]. Эти методы являются менее чувствительными по сравнению с атомной и масс-спек-трометрией, а также при их применении перед детектированием требуется предварительное переведение всех анализируемых форм в одну [34]. Одним из современных и широко распространенных методов определения микроэлементов является масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой. Достоинствами данного метода являются: высокая чувствительность, хорошая воспроизводимость результатов, широкий динамический диапазон, возможность детектирования форм большинства химических элементов, параллельное определение элементов, возможность работать в on-line режиме [12]. По мнению Иваненко Н.Б., метод масс-спектро-метрии с индуктивно связанной плазмой не имеет альтернативы при работе с биосубстратами, такими как сыворотка и плазма крови, амниотическая жидкость, ликвор, моча, экстракты цитозоля клеток, поскольку применение иных детекторов ограничено низким содержанием микроэлементов в данных субстратах [12]. На данный момент в литературе опубликован ряд сообщений о применении метода масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой при определении селена, так, Улановой ТС. с соавторами были получены результаты о содержании селена в моче, определенного данным методом [26]. Существенным недостатком масс-спектрометрического метода определения селена является Выпуск 3 (67). 2018 15 ЩШгорСз [ЩсмеТКЩ высокая стоимость анализов и оборудования, необходимого для его проведения. Отечественные авторы с целью определения микроколичеств селена в биологических средах, в том числе и слюне, применяют метод инверсионной вольтампе-рометрии. По их мнению, данный метод обладает высокой чувствительностью, низкими пределами обнаружения селена и легкостью автоматизации аналитических определений. Порог определения селена в различных объектах данным способом составляет 5*8-8 ммоль/л [2]. По мнению ряда авторов, метод инверсионной вольтамперометрии является весьма перспективным для определения селена в различных средах. Метод прост в исполнении и не требует дорогостоящего оборудования. Как правило, определение содержания селена данным методом проводят, используя аналитический сигнал селена (IV), полученный при анодной или катодной развертке поляризующего напряжения. В качестве индикаторного электрода в анодной инверсионной вольтамперометрии для определения селена наиболее часто используется золото-графитный электрод. Однако чувствительность данного способа определения недостаточна для анализа объектов с естественным содержанием селена на уровне 0,05 мкг/л и ниже), к тому же мешающее действие хлоридов осложняет процедуру анализа и негативно сказывается на работе электрода [1]. По мнению зарубежных авторов, применение вольтамперометрических методов при определении форм микроэлементов в биологических субстратах практически невозможно, вследствие их низкой чувствительности и селективности [30]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, несмотря на многообразие существующих методов определения селена в биологических объектах, наибольшее предпочтение ученые отдают флу-ориметрическому методу, поскольку он удобен и прост в применении, обладает высокой чувствительностью и не требует больших финансовых затрат на оборудование и расходные материалы. Невзирая на разработку и внедрение современных физико-химических методов определения селена, флуориметрический метод считается одним из наиболее надежных. Поскольку работ, посвященных изучению содержания селена в ротовой жидкости при различных состояниях, в том числе при воспалительных заболеваниях пародонта, практически нет, требуется дальнейшее изучение данного вопроса. ЛИТЕРАТУРА

About the authors

D. A Dybov

FSBEI HE «Far Eastern State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

A. V Yurkevich

FSBEI HE «Far Eastern State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

Email: dokdent@mail.ru

I. D Ushnitsky

FSAI HE «North-Eastern Federal University named after M.K. Ammosov»

References

Supplementary files