ОБОСНОВАНИЕ ВЫБОРА МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ УРОВНЯ СОДЕРЖАНИЯ СЕЛЕНА В РОТОВОЙ ЖИДКОСТИ У ЛИЦ C ХРОНИЧЕСКИМ ГЕНЕРАЛИЗОВАННЫМ ПАРОДОНТИТОМ

Полный текст

Selenium, methods of determination, salivadiagnostics, periodontitis. Открытие селена связано с именами двух шведских ученых И. Берцелиусом и Г. Ганном, исследовавших в 1817 г. осадки, образовавшиеся в свинцовой камере при производстве серной кислоты. В настоящее время эссенциальная роль этого элемента для всего живого доказана как отечественными, так и зарубежными учеными [4, 12, 35]. Значение селена очень велико, поскольку он необходим для нормальной жизнедеятельности всего организма [4, 12]. Этот микроэлемент входит в состав селенопротеинов, важных антиоксидантных ферментов, которые препятствуют повреждению клеток свободными радикалами [20, 28, 31]. Главным антиок-сидантным селенозависимым ферментом является глу-татионпероксидаза, она способна разлагать токсичную перекись водорода до двух молекул воды [23], а ее активность имеет прямую зависимость от содержания селена в крови [33]. Селенопротеиды принимают участие в работе щитовидной железы, оказывают влияние на иммунную систему. Кроме того, селен способствует выведению тяжелых металлов [3, 31]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Проанализировать методы исследования уровня содержания селена в ротовой жидкости у лиц с хроническим генерализованным пародонтитом. По данным литературы, в организме человека селен содержится в количестве 10-20 мг [4]. Основная масса селена (около 80 %) находится в виде селеноци-стеина, причем селен в данном соединении находится в практически полностью ионизированном виде, что обуславливает его чрезвычайно эффективную каталитическую активность [8]. В организме человека селен накапливается в печени и почках. Его содержание в крови находится в пределах 0,001-0,004 ммоль/л [3]. Согласно данным литературы, до 80 °% населения России имеет недостаточную обеспеченность селеном [23, 24]. При дефиците селена у детей нарушаются процессы роста, снижается иммунитет, развиваются дерматиты и экземы [12]. Недостаток селена существенно повышает риск развития онкологических заболеваний, негативно влияет на функцию щитовидной железы, что, в свою Выпуск 3 (67). 2018 13 ЩШгорСз [ЩсмеТКЩ очередь, становится причиной нарушения всех видов обмена веществ в организме человека. На сегодняшний день доказано, что потребление селена снижает риск развития заболеваний органов кровообращения, онкопатологии и способствует увеличению продолжительности жизни [3]. Еще в 1996 г. в работе Clark L.C. c соавторами была продемонстрирована противоопухолевая активность селена [29]. В стоматологии c селен-дефицитными состояниями связано большое количество заболеваний зубов и пародонта [20, 10]. В свою очередь, множество биологических процессов в организме оказывают непосредственное влияние на структурно-пролиферативные процессы в тканях пародонта, чему посвящено значительное количество работ [14-19, 27]. Установление эссенциальной роли селена для жизнедеятельности организма человека стимулировало разработку и совершенствование аналитических методов его определения [5]. В основном интерес ученых был сосредоточен на определении содержания селена в окружающей среде, продуктах питания и т.д. Однако методы количественного и качественного определения селена постепенно нашли свое применение и в медицине. При этом большая часть работ, посвященных изучению содержания селена в организме человека в норме и при различных патологических состояниях, базируется на его определении в сыворотке крови, волосах и моче [5, 12, 26]. В последнее время интерес ученых всего мира вызывают возможности саливадиагностики. С каждым днем растет количество проведенных исследований, указывающих на ее перспективность [25]. Ротовая жидкость является сложным по составу биологическим материалом. Ее состав формируется из компонентов секретов крупных, малых и второстепенных слюнных желез, сальных желез и зубо-десневой жидкости [21], также в ее состав входят лейкоциты, десквамированные клетки эпителия, пищевой детрит и различные микроорганизмы. На состав ротовой жидкости оказывают влияние множество факторов: общее состояние организма человека, функциональная активность слюнных желез, вязкость слюны, состав пищи, гигиеническое состояние полости рта [23]. Тонкий структурный анализ ротовой жидкости играет важнейшую роль в диагностике, прогнозе, профилактике и лечении различных заболеваний, в том числе и воспалительных заболеваний пародонта. Современными исследованиями доказано наличие взаимосвязи между метаболическими показателями крови и ротовой жидкости при различных заболеваниях [9]. В настоящее время саливадиагностика считается признанной технологией для обнаружения в организме человека наркотиков, алкоголя, никотина, фармпрепаратов, онкомаркеров, ДНК, экзотоксинов [21]. В отличие от хорошо изученных рутинных методов анализа крови данный метод обладает бесспорными преимуществами. Наряду с высокой информа тивностью, его достоинствами является простой и безболезненный забор материала в требуемом количестве [6, 14, 25]. Кроме того, ротовая жидкость легко хранится [6]. На протяжении многих лет проблема определения селена в различных биологических средах не теряет своей актуальности. При определении данного микроэлемента в биоматериалах существуют трудности, связанные с ограничениями существующих методов измерения [11]. Несмотря на то, что предложено множество методик его определения в различных биологических средах, по сей день ученые не имеют единого мнения, какой способ наиболее оптимален для этих целей, а исследований, посвященных изучению содержания селена в ротовой жидкости при различных заболеваниях, практически нет. Согласно данным литературы, определить содержание селена можно, используя такие методы, как атомно-эмиссионный, атомно-абсорбционный, нейтронноактивационный, флуориметрический, фотометрический и масс-спектрометрический с индуктивно-связанной плазмой, инверсионно-вольтамперометрический, хроматографический и другие [5, 11]. Каждый из методов имеет свои ограничения, связанные в основном с нижним пределом обнаружения селена, селективностью, используемой аналитической аппаратурой, стоимостью необходимого оборудования [5]. Появление сообщения Д. Уоткинсона о применении 2,3-диаминонафтали-на, впервые описанного в 1962 г., способствовало появлению эффективного метода определения селена, который нашел широкое применение, в том числе и в медицине [11]. По мнению ряда авторов, определение селена посредством флуориметрического метода с 2,3-диами-нонафталином является наиболее приемлемым, поскольку он отличается высокой чувствительностью и специфичностью, не требует дорогостоящего и сложного оборудования. Предел обнаружения селена с его использованием составляет 8*10-1-8*10-8 %. Флуоримет-рический метод применяется для исследования содержания селена в различных биологических средах, продуктах питания, почвах и так далее [5]. Флуориметрический метод определения селена включает три стадии: мокрое сжигание органической части образца окислительной смесью с помощью азотной и хлорной кислот при высокой температуре, восстановление селена (VI) до селена (IV) соляной кислотой при нагревании и конденсацию селенистой кислоты с ДАН, в результате которой образуется 4,5-пиазоселе-нола, интенсивность флуоресценции которого пропорциональна содержанию селена в пробе [5]. Применение флуориметрического метода сопряжено с такими трудностями, как окисление реагента 2,3-диаминонафталина и мешающим влиянием матричных компонентов [11]. К существенным недостаткам данного метода определения селена относится необходимость строгого соблюдения оптимальных условий, 14 Выпуск 3 (67). 2018 полноты окисления органической части образца и устранения влияния других элементов [2]. Учеными предложены различные модификации данного метода определения селена с целью улучшения его чувствительности и повышения точности результатов. Так, в результате проведенных исследований Бутько З.Т. с соавторами был предложен модифицированный флуориметрический метод определения содержания селена в продуктах питания и биологических материалах с применением автоклавной минерализации образцов. В качестве окисляющей смеси автором использовалась концентрированная азотная кислота и 50%-я перекись водорода в соотношении 6:1. Было установлено, что оптимальными условиями реакции конденсации являются: рН растворов в диапазоне от 1,8 до 2,0; время - 30 мин, а в качестве органического растворителя 4,5-пиазоселенола - циклогексан [5]. Крыловой А.Н. с соавторами описан метод определения селена в биологическом материале с использованием дитизона. Данный метод обладает такой же чувствительностью (0,08 мкг/мл), как и методы с использованием диаминонафталина, диаминобензидина, но технически он проще и доступнее. Присутствие железа в количестве до 5 мг не мешает определению селена по дитизонату, а более высокое содержание железа (10 мг) завышает результаты до 6 %. Недостатком метода определения селена по дитизонату является высокая окисляемость дитизона, образующего продукты окисления, которые обладают близкими к дитизонату селена светопоглощением [13]. В процессе аналитических работ, проведенных Ермаковым В.В. и соавторами, было выявлено, что метод спектрфлуориметрии в сочетании с высокоэффективной жидкостной хроматографией имеет преимущества по сравнению с классическим исполнением данного метода [11]. С учетом сложностей при спектрфлуориметричес-ком определении селена в биоматериалах японскими учеными был предложен методический прием - применение спектрфлуориметрического варианта в сочетании с высокоэффективной жидкостной хроматографией [32]. Этот прием дает возможность отделить основное комплексное соединение селена от примесей, образующихся в процессе анализа. Также в исследовании Ермакова В.В.с соавторами показано, что определение селена методом атомноабсорбционной спектрометрии в сыворотки крови является более эффективным, чем при определении селена с помощью флуориметрического метода. В процессе измерений концентраций селена посредством атомноабсорбционной спектрометрии с термической атомиза-цией существенную роль играет модификатор матрицы. Как правило, хорошие результаты дает применение нитрата палладия. Подобные результаты получены автором и с нитратом никеля [11]. Газовая хроматография относится к числу хроматографических методов. Она достаточно редко приме няется в практике, и, как правило, ее использование ограничивается определением летучих форм селена. Газовая хроматография-масс-спектрометрия является одним из комбинированных методов количественного и качественного анализа широкого круга соединений. Этот метод сочетает в себе два мощных аналитических инструмента: газовую хроматографию, которая обеспечивает высокоэффективное разделение компонентов сложных смесей в газовой фазе, и масс-спектромет-рию, позволяющую идентифицировать все компоненты смеси. Еще в середине прошлого века были предложены различные варианты применения газового хроматографа в качестве системы разделения и ввода пробы в масс-спектрометр [36]. Газовая хроматография-масс-спектрометрия высокоспецифично характеризует вещества по газохроматографическим индексам удерживания и масс-спектрам. Вещества с перекрывающимися хроматографическими пиками различают по их масс-спектрам. С другой стороны, изомеры с похожими или идентичными масс-спектрами различают по индексам удерживания. Газовая хроматография и масс-спектрометрия дополняют друг друга при анализе смесей. Однако в клинической практике данный метод не получил широкого распространения [7]. В работе Иваненко Н.Б. с соавторами отмечено, что применение классических электрохимических и фотометрических детекторов при хроматографическом или электрофоретическом определении форм микроэлементов ограничено [12]. Эти методы являются менее чувствительными по сравнению с атомной и масс-спек-трометрией, а также при их применении перед детектированием требуется предварительное переведение всех анализируемых форм в одну [34]. Одним из современных и широко распространенных методов определения микроэлементов является масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой. Достоинствами данного метода являются: высокая чувствительность, хорошая воспроизводимость результатов, широкий динамический диапазон, возможность детектирования форм большинства химических элементов, параллельное определение элементов, возможность работать в on-line режиме [12]. По мнению Иваненко Н.Б., метод масс-спектро-метрии с индуктивно связанной плазмой не имеет альтернативы при работе с биосубстратами, такими как сыворотка и плазма крови, амниотическая жидкость, ликвор, моча, экстракты цитозоля клеток, поскольку применение иных детекторов ограничено низким содержанием микроэлементов в данных субстратах [12]. На данный момент в литературе опубликован ряд сообщений о применении метода масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой при определении селена, так, Улановой ТС. с соавторами были получены результаты о содержании селена в моче, определенного данным методом [26]. Существенным недостатком масс-спектрометрического метода определения селена является Выпуск 3 (67). 2018 15 ЩШгорСз [ЩсмеТКЩ высокая стоимость анализов и оборудования, необходимого для его проведения. Отечественные авторы с целью определения микроколичеств селена в биологических средах, в том числе и слюне, применяют метод инверсионной вольтампе-рометрии. По их мнению, данный метод обладает высокой чувствительностью, низкими пределами обнаружения селена и легкостью автоматизации аналитических определений. Порог определения селена в различных объектах данным способом составляет 5*8-8 ммоль/л [2]. По мнению ряда авторов, метод инверсионной вольтамперометрии является весьма перспективным для определения селена в различных средах. Метод прост в исполнении и не требует дорогостоящего оборудования. Как правило, определение содержания селена данным методом проводят, используя аналитический сигнал селена (IV), полученный при анодной или катодной развертке поляризующего напряжения. В качестве индикаторного электрода в анодной инверсионной вольтамперометрии для определения селена наиболее часто используется золото-графитный электрод. Однако чувствительность данного способа определения недостаточна для анализа объектов с естественным содержанием селена на уровне 0,05 мкг/л и ниже), к тому же мешающее действие хлоридов осложняет процедуру анализа и негативно сказывается на работе электрода [1]. По мнению зарубежных авторов, применение вольтамперометрических методов при определении форм микроэлементов в биологических субстратах практически невозможно, вследствие их низкой чувствительности и селективности [30]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, несмотря на многообразие существующих методов определения селена в биологических объектах, наибольшее предпочтение ученые отдают флу-ориметрическому методу, поскольку он удобен и прост в применении, обладает высокой чувствительностью и не требует больших финансовых затрат на оборудование и расходные материалы. Невзирая на разработку и внедрение современных физико-химических методов определения селена, флуориметрический метод считается одним из наиболее надежных. Поскольку работ, посвященных изучению содержания селена в ротовой жидкости при различных состояниях, в том числе при воспалительных заболеваниях пародонта, практически нет, требуется дальнейшее изучение данного вопроса. ЛИТЕРАТУРА

Об авторах

Д. А Дыбов

ФГБОУ ВО «Дальневосточный государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Александр Владимирович Юркевич

ФГБОУ ВО «Дальневосточный государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: dokdent@mail.ru
д. м. н., доцент, зав. кафедрой стоматологии ортопедической

И. Д Ушницкий

ФГАОУ ВО «Северо-Восточный федеральный университет им. М.К. Аммосова»

Список литературы

Дополнительные файлы