ENDOTHELIOPROTECTIVE AND ANTIAGGREGANT EFFECT OF PRIMULA VERIS L. SOLID HERBAL EXTRACT IN EXPERIMENTAL CHRONIC HEART FAILURE

Full Text

Primula veris L. solid herbal extract, endotheliocyte and antiaggregant effect, chronic heart failure. Хроническая сердечная недостаточность (ХСН) мой из-за большой распространенности и высокого является как медицинской, так и социальной пробле- уровня смертности больных от данной нозологии [5]. Выпуск 3 (67). 2018 37 ЩШгорСз [ЩсмеТКЩ Эпидемиологические данные свидетельствуют о росте заболеваемости ХСН в мире [6]. В развитии сердечной недостаточности большое значение придают эндотелиальной дисфункции (ЭД), ключевыми детерминантами которой являются снижение биодоступности оксида азота и образование большого количества активных форм кислорода (АФК) [11, 16, 18). При этом нарушается эндотелийзависимая ди-латация сосудов, повышается адгезия и агрегация тромбоцитов [11, 12]. В настоящее время ведется активный поиск и разработка средств, оказывающих терапевтическое влияние на сосудистый эндотелий [15, 16, 17]. Большое внимание уделяется растительным препаратам, которые обладают антиоксидантными свойствами [20] и могут быть более эффективными по сравнению с синтетическими препаратами, т. к. являются многокомпонентными соединениями и имеют плейотропные многоцелевые мишени и свойства [21]. Полифенолы, содержащиеся в растениях, могут противодействовать окислительно-индуцированному повреждению тканей посредством их модуляторного действия на внутриклеточные сигнальные пути [13]. Густой экстракт из травы первоцвета весеннего (ГЭТПВ) является богатым источником полифенольных соединений, обладающих антиоксидантной активностью [4], что позволяет предположить наличие у него эн-дотелиопротекторных и антиагрегантных свойств. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Изучение влияния ГЭТПВ на эндотелийзависимую вазодилатацию и агрегацию тромбоцитов у животных в условиях экспериментальной ХСН. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты проведены на беспородных кры-сах-самках массой 300-340 г, полученных из питомника «Рапполово» РАН (Ленинградская область). Животные содержались в стандартных условиях вивария согласно правилам GLP при проведении доклинических исследований в РФ (Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 01.04.2016 № 199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики»). Экспериментальное исследование было одобрено Экспертным советом по биомедицинской этике (локальным этическим комитетом) ФГБОУ ВО БГМУ МЗ РФ (протокол № 10-2016 от 27.10.2016 г). ХСН моделировали введением L-изопротеренола (Sigma-Aldrich, США) в дозе 2,5 мг/кг дважды в сутки внутрибрюшинно в течение 21 дня. [14]. Было сформировано 4 группы: 1) интактные животные (n = 15), которым вводили дистиллированную воду перорально и физиологический раствор внутрибрюшинно; 2) контрольная группа - самцы с изопротереноловой ХСН («ХСН + физ.р-р») (n = 20), получавшие дистиллированную; 3-я и 4-я опытные группы - животные с ХСН, которым вводили ГЭТПВ в дозе 30 мг/кг («ХСН + ГЭТПВ 30 мг/кг» (n = 15)) и препарат сравнения милдронат (АО «Г риндекс», Латвия) в дозе 50 мг/кг («ХСН+милд-ронат» (n = 15)) Животные получали дистиллированную воду и исследуемые препараты перорально в объеме 0,1 мл на 100 г веса 1 раз в день с первых суток введения изопротеренола и в течение последующих 3 недель. Затем животные из каждой группы были разделены на 2 подгруппы по 7-9 особей. У одной подгруппы изучали влияние ГЭТПВ на вазодилатирующую функцию эндотелия, которую определяли по изменению кровотока в сонной артерии при модификации синтеза эндогенного NO внутривенным введением анализаторов - ацетилхолина (АЦХ) (0,01 мг/кг, Acrosorganics, США); нитроглицерина (0,007 мг/кг, МТХ, Москва) и нитро^-аргинина - блокатора синтеза NO (10 мг/кг, Acrosorganics, США) с использованием метода высокочастотной ультразвуковой допплерографии (Минимакс - Допплер-К, Санкт-Петербург) [10]. У второй подгруппы наркотизированных (хлоралгидрат, 400 мг/кг) животных из брюшного отдела аорты осуществляли забор крови для определения показателей агрегации тромбоцитов. Кровь стабилизировали 3,8%-м раствором цитрата натрия в соотношении 9:1. На двухканальном лазерном анализаторе (модель 220 LA) научно-производственной фирмы «Биола» (г Москва, Россия) определяли степень и скорость агрегации по методу G. В. Born в модификации З.А. Габбасова. и соавт. [1] (в качестве индуктора агрегации тромбоцитов использовали АДФ («Renal», Венгрия) в конечной концентрации 5 мкМ), а также фактор Виллебранда (фВ). Метод основан на его способности вызывать агглютинацию тромбоцитов в присутствии антибиотика ристоцети-на (ристомицина), которая сохраняется у тромбоцитов после их фиксации формальдегидом, когда полностью утрачивается реакция на другие индукторы агрегации. Затем строили калибровочный график, который представляет собой прямую линию в диапазоне активности фВ от 10 до 100 %. По калибровочному графику определяли активность фВ в %. Артериальное давление (АД) животным измеряли неинвазивным способом с хвоста при помощи компьютерной системы Kent Scientific Corporation (США) до начала эксперимента и при его завершении. Статистическую обработку проводили с использованием стандартных методов вариационной статистики пакета программ «Statistica 10». Данные были проверены на предмет характера распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка. При нормальном распределении для расчета использовался критерий Ньюмена-Кей-лса, а при распределении, отличном от нормального -тест Крускала-Уоллиса с пост-хок тестом Данна. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ У интактных животных к концу эксперимента систолическое (САД) и диастолическое артериальное давление (ДАД) статистически значимо не изменялось. 38 Выпуск 3 (67). 2018 üssmpfä 1)<§тППЩ| В контрольной группе САД и ДАД уменьшилось на 21-е сутки эксперимента относительно значений, полученных до моделирования ХСН (р < 0,05) (рис. 1). Это согласуется с литературными данными (снижение сердечного выброса при ХСН может привести к снижению АД) [8]. У крыс, получавших ГЭТПВ и препарат сравнения милдронат, в течение моделирования ХСН систолическое и диастолическое АД статистически значимо не менялось. 20 %/мин и 19 % и 23,2 %/мин и 21,9 % соответственно (р < 0,05) (рис. 3). Ü Интактная ХСН+физ. р-р ХСН+ГЭТП В 30 мг/кг ХСН+милдронат 50 і мг/кг § s Группы животных ■ САД исходные данные ■ САД 21 день Относительно показателей группы интактных животных при р < 0,05; **относительно показателей контрольной группы животных с ХСН при р < 0,05. Рис. 1. Влияние ГЭТПВ на систолическое и диастолическое АД животных с экспериментальной ХСН (М ± ст) В группе животных с ХСН ацетилхолин на 21,2 % повышал, а неселективный ингибитор NO-синтаз L-NAME на 27,5 % снижал скорость кровотока в сонной артерии крыс, что было меньше аналогичных значений в интактной группе: 45,2 и -46,8 % соответственно (р < 0,05). У крыс, получавших ГЭТПВ и милдронат, ведение ацетилхолина вызывало увеличение кровотока в сонной артерии в большей степени, чем у животных с ХСН контрольной группы -на 43,4 и 43,8 % соответственно (р < 0,05). Неселективный ингибитор NO-синтаз L-NAME снижал кровоток наиболее выражено - на 40,4 % (р < 0,05) у животных, получавших исследуемые препараты. При введении нитроглицерина повышение кровотока отмечалось у всех групп животных без статистически значимых различий (рис. 2). Изучение антиагрегантной активности ГЭТПВ показало, что скорость и степень агрегации тромбоцитов выше у крыс с ХСН по сравнению с интактны-ми животными (29,6 %/мин против 20,6 %/мин и 27,3 % против 18,8 % соответственно) (р < 0,05). У животных с ХСН, которым вводили ГЭТПВ и милдронат, исследуемые показатели были достоверно ниже в сравнении с контрольной группой и равнялись Ацетилхолин ** ** Нитроглицерин L -NAME 5° -і ^ 40 o' g 30 - I 20 ■ 0 а 10 - 1 о с о. S -10 и Ь -20 - О с- J. -30 -"" -40 -50 О Интактная □ ХСН + дисгг. вода □ ХСН + ГЭТПВ 3 0 мг/кг В ХСН + милдронат 5 0 мг/кг Относительно показателей группы интактных животных при р < 0,05; **относительно показателей контрольной группы животных с ХСН при р < 0,05. Рис. 2. Влияние ГЭТПВ на скорость кровотока в сонной артерии при введении ацетилхолина, нитроглицерина, L-NAME (М ± ст) (** ** ■ I ХСН+физ. р-р ХСН+ГЭТПВ 30 ХСН+милдронат мг/кг 50 мг/кг группы животных ■ степень агрегации,% ■ Скорость агрегации, %/мин *Относительно показателей группы интактных животных при р < 0,05; **относительно показателей контрольной группы животных с ХСН при р < 0,05. Рис. 3. Влияние ГЭТПВ на степень и скорость агрегации тромбоцитов (М ± ст). Выявлено, что уровень фВ был на 91,1 % (р < 0,05) выше у животных с ХСН контрольной группы по сравнению с интактными. У самок с ХСН, получавших ГЭТПВ и милдронат, показатель был ниже на 31,4 (р < 0,05) и 21,2 % (р < 0,05) соответственно по отношению к контрольной группе крыс с ХСН (табл.). Влияние ГЭТПВ и милдроната на уровень фактора Виллебранта при экспериментальной ХСН (М ± а) Показатель, % Группы животных Интактная+дист. вода (n = 7) ХСН+дист. вода (n = 9) ХСН+ГЭТПВ 30 мг/кг (n = 8) ХСН+милдронат 50 мг/кг (n = 7) Фактор Виллебранда 95,1 ± 7,5 95,1 ± 7,5 120,9 ± 5,7**д 138,9 ± 16,0 Относительно показателей группы интактных животных;**контрольной группы животных с ХСН; дгруппы животных с ХСН+милдронат, р < 0,05. * Интактная Выпуск 3 (67). 2018 39 ЩШгорСз [ЩсмеТКЩ Таким образом, в условиях экспериментальной хронической сердечной недостаточности нарушается вазодилатирующая функция эндотелия, активируются процессы тромбообразования, о чем свидетельствует менее выраженная реакция сосудов на введение модуляторов синтеза оксида азота ацетилхолина и L-NAME, увеличение скорости и степени агрегации тромбоцитов у животных контрольной группы. Кроме того, у самок с ХСН в крови повышена концентрация фВ, который является общепризнанным маркером эндотелиальной дисфункции. Вероятно, вышеперечисленное связано с тем, что при ХСН развивается хроническая гипоксия тканей, характеризующаяся накоплением свободных радикалов в клетках за счет разобщения окислительного фосфорилирования и активации окси-геназ. При этом истощаются антиоксидантные системы, в организме развивается состояние окислительного стресса. АФК повреждают эндотелий сосудов, снижается секреция оксида азота (NO), что приводит к усугублению дисфункции эндотелия, усиленной вазо-констрикции и гиперагрегации тромбоцитов [2]. ГЭТПВ ограничивает нарушение функции эндотелия при экспериментальной ХСН, о чем свидетельствует более низкий уровень фВ в крови, улучшение вазоди-латирующей функции, на что указывает прирост кровотока в сонной артерии на введение ацетилхолина и снижение L-NAME у самок, получавших вещество, статистически значимо превосходящие таковые у крыс контрольной группы. Выявлено, что ГЭТПВ обладает анти-агрегантным действием, скорость и степень агрегации тромбоцитов у животных с ХСН, которым вводили вещество, были существенно ниже, чем в контрольной группе. Очевидно, ГЭТПВ ограничивает формирование АФК, что показано и в ранее проведенных нами экспериментах [9]. В его состав входят гидрофильные и липофиль-ные биологически активные вещества, среди которых важное место занимают полифенольные соединения -флавоноиды, которые способны ограничивать повреждения эндотелия, вызванные АФК, и оказывать антиаг-регантное действие. Это разнообразные соединения по структуре, широко распространенные в растениях, находятся в настоящее время в фокусе внимания исследователей ввиду их высокой и разносторонней активности и низкой токсичности [3]. В литературе имеется большое количество данных, свидетельствующих об их антиоксидантном и антиагрегантном действии. Показано, что листья, цветы и плоды боярышника (Crataegus) содержат флавоноиды, экстракт из плодов боярышника способен ограничивать развитие оксидативного стресса и ингибировать образование тромбоксана [7]. Шалфей краснокорневищный (Salvia miltiorrhiza) может подавлять агрегацию тромбоцитов за счет влияния на циклический аденозинмонофосфат, ингибирование фосфодиэстеразы, защищает мембраны митохондрий от повреждения свободными радикалами [19]. Пятичленник китайский (Penthorum chinense Pursh) богат флавоноидами, которые обладают выраженной антиоксиданной активностью, способны связывать свободные радикалы и восстанавливать железо [22]. В связи с вышесказанным, можно предположить, что эндотелиопротекторное и антиагрегантное действие ГЭТПВ обусловлено его способностью ограничивать развитие оксидативного стресса. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ГЭТПВ обладает эндотелиопротекторным действием, снижает скорость и степень агрегации тромбоцитов животных в условиях экспериментальной ХСН. Можно считать перспективной разработку на его основе лекарственного средства, ориентированного на эндотелий. ЛИТЕРАТУРА

About the authors

M. A Bychenkova

FSBEI HE «Bashkir State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

V. N Perfilova

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

Email: vnperfilova@mail.ru

G. M Latypova

FSBEI HE «Bashkir State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

V. A Kataev

FSBEI HE «Bashkir State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

References

Supplementary files