THE RESULTS OF THE RESEARCH ACTIVITY OF SILVER. NANOPARTICLES IN VITRO AND IN VIVO AGAINST DRUG- RESISTANT MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS STRAINS

Full Text

Experimental tuberculosis, isoniazid, silver nanoparticles. Туберкулез продолжает представлять серьезную тыс. населения. В связи недостаточной эффективнос-угрозу человечеству. Ежегодно он становится причиной тью лечения и критическим ростом устойчивости МБТ к смерти около 1,5 млн человек на планете, не считая противотуберкулезным препаратам, в Федеральных кли-умерших от туберкулеза при ВИЧ-инфекции [2]. нических рекомендаций по диагностике и лечению ту-В России в 2017 г. показатель смертности от туберкуле- беркулеза органов дыхания с множественной и широ-за составил 6,4 на 100 тыс. населения [4]. Несмотря на кой лекарственной устойчивостью возбудителя (2015) стабилизацию и положительные тенденции в развитии рекомендуется проводить научный поиск средств, по-эпидемиологической ситуации по туберкулезу в России тенцирующих действие противотуберкулезных препара-и мире, неблагоприятный прогноз в ближайшие годы будет тов и называемых адъювантами химиотерапии, то есть определяться двумя важнейшими факторами - увели- веществами, усиливающими или пролонгирующими чением количества ВИЧ-инфицированных и ростом мно- действие лекарственных средств. В мировой и отече-жественной лекарственной устойчивости МБТ (МЛУ-МБТ) ственной научной литературе опубликованы результаты [1]. По данным официальной статистики, сочетание ту- многочисленных исследований, свидетельствующие о беркулеза с ВИЧ-инфекцией в РФ увеличилось за пери- выраженной антибактериальной активности наночастиц од 2013-2017 гг. с 6,4 до 8,3 на 100 тыс. населения. За серебра на широкий круг инфекционных агентов, в том этот же период количество больных, выделяющих воз- числе на лекарственно-устойчивые штаммы [3, 5, 7-10]. будителя с МЛУ-МБТ, возросло с 17,4 до 27,4 на 100 Эти исследования явились предпосылкой для изучения Выпуск 3 (67). 2018 43 ЩШгорСз противотуберкулезной активности наночастиц. Модельным препаратом для изучения потенцирующих свойств наночастиц был выбран изониазид, учитывая его высокую актуальность в режимах современной химиотерапии и профилактики туберкулеза, в том числе у ВИЧ-инфицированных пациентов. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Разработка в эксперименте способов повышения эффективности лечения туберкулеза с устойчивостью возбудителя к изониазиду при сохраненной чувствительности к рифампицину путем научного обоснования эффективности применения в сочетании с химиотерапией наночастиц серебра. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Использовали водный раствор наночастиц серебра, полученный электрохимическим методом, с размером наночастиц 3-60 нм. In vitro изучали подавляющую активность наночастиц серебра на МБТ в изолированном варианте и в сочетании с изониазидом. Тестировали концентрации наночастиц - 5; 25 и 50 мкг/мл. Концентрация изониазида составляла 1 мкг/мл. Исследования проводили на 117 клинических изолятах МБТ с устойчивостью к изониазиду и другим препаратам при сохраненной чувствительности к рифампицину (1 -я группа) и 108 изолятах с МЛУ-МБТ (2-я группа). Антибактериальную активность наночастиц серебра оценивали по способности подавлять рост лекарственно устойчивых штаммов микобактерий, которая рассчитывалась по соотношению количества колонии образующих единиц (КОЕ) в контрольных и опытных образцах. Протокол исследования соответствовал действующим на момент выполнения научной работы нормативным документам -«Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ», 2005, приложением к Приказу МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 «Правила лабораторной практики в Российской Федерации» [6]. При полном или значительном подавлении роста МБТ, то есть при росте до 20 колоний, результат оценивали как бактерицидный, при умеренном подавлении - как бактериостатический. Модель туберкулеза создавали на мышах имбредной линии BALB/c, используя двухнедельную вирулентную культуру M. tuberculosis клинического штамма, полученного от больного туберкулезом, с лекарственной устойчивостью возбудителя к изониазиду (1 мкг/мл), рифампицину (40 мкг/мл), стрептомицину (25 мкг/мл). Подопытных животных заражали внутривенно в область ретроорби-тального синуса, при этом инфицирующая доза составляла 5х106 колониеобразующих единиц (КОЕ). Основными критериями эффективности лечения являлись: показатели выживаемости животных и высеваемос-ти МБТ из лёгочной ткани. Высеваемость возбудителя определяли как среднее значение из общего количества колониеобразующих единиц на каждую группу. Интенсивность роста культуры определяли в условных единицах (у. е.) по четырехбалльной системе, предложенной Г.Н. Першиным [6]. Статистическую достоверность показателей оценивали с использованием коэффициента Стьюдента, рассчитываемого по формуле: t = M1-M2/Vm12 + m22, считая разницу достоверной при вероятности 95 % и более (р < 0,05). Статистическую обработку проводили с использованием программы Microsoft Excel 2007 и статистической компьютерной программы «Биостатика». РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Результаты подавляющей активности наночастиц серебра на клинические изоляты возбудителя в монорежиме и в сочетании с изониазидом представлены в диаграмме на рис. 1. Бактерицидное действие (полное и значительное подавление роста возбудителя) изолированных наночастиц на изоляты 1-й группы наблюдалось в 48,1 % опытов, бактериостатическое - в 29,6 %. При сочетанном использовании наночастиц с изониа-зидом (нанокомпозит) аналогичные показатели составили 65,3 и 21,9 % соответственно. Таким образом, прирост бактерицидного действия в 1-й группе составил 17,2 % (р < 0,05). п пол ное 20,5% 17,3% 40,5% 28,7% в значител ьное 27,6% 24,4% 24,8% 31,8% и умеренное 29,6% 31,8% 21,9% 25,3% и отсутствует 22,2% 26,5% 12,8% 14,2% Рис. 1. Подавление роста изолятов МБТ. А (1-2-я группы) - изолированные наночастицы, Б (1-2-я группы) - нанокомпозит Во 2-й группе при использовании наночастиц в монорежиме бактерицидный эффект составил 41,7 %, бактериостатический - 31,8 %. Применение нанокомпозита обеспечило бактерицидное действие в 60,5 %, бактериостатическое - в 25,3 % наблюдений. Таким образом, прирост бактерицидного действия во 2-й группе составил 18,8 % (р < 0,05). Результаты изучения подавляющей активности наночастиц серебра in vitro свидетельствуют о самостоятельной противотуберкулезной активности наночастиц, а также о синергидном эффекте совместного применения их с изониазидом. В эксперименте in vivo изучали противотуберкулезную эффективность наночастиц серебра в монорежиме и в составе нанокомпозита с изониазидом. В контрольной А-группе было 10 инфицированных мышей линии BALB/c, не получавших лечение. В контрольной А-1 А-2 Б-1 Б-2 44 Выпуск 3 (67). 2018 ©зеторСз 1)<§тППЩ| B-группе 10 мышей получали лечение изониазидом в дозе 50 мг/кг. В экспериментальных C- и D-группах по 20 особей в каждой животные получали лечение соответственно наночастицами в монорежиме и нанокомпозитом. В соответствии с протоколом эксперимента, опыт заканчивался на момент гибели всех мышей, не получавших лечение. Динамика гибели экспериментальных животных представлена в табл. Из представленных данных следует, что максимальная выживаемость (90 %) на момент окончания эксперимента наблюдалась в группе D, где в лечении использовался нанокомпозит. Выживаемость 40 % отмечена при лечении изониазидом, при этом следует отметить, что возбудитель, которым инфицировали мышей, имел устойчивость к этому препарату. Тем не менее, наблюдался протек-тивный эффект, вероятно, связанный с более высокими дозами изониазида, применявшимися в лечении. Наночастицы в монорежиме, которые использовались при лечении животных в группе С, также оказали положительное влияние на выживаемость мышей. Таким образом, наиболее высокую эффективность в лечении экспериментального лекарственно-устойчивого туберкулеза продемонстрировал нанокомпозит, состоящий из наночастиц серебра и изониазида. Проводя анализ полученных результатов, можно говорить о потенцирующем действии наночастиц на изониазид, к которому МБТ имела устойчивость. Показатели высеваемости M. tuberculosis из легочной ткани экспериментальных животных представлены в диаграмме на рис. 2. Наименьший показатель высеваемости, свидетельствующий о наибольшей эффективности лечения, зафиксирован в D-группе, где наночастицы применялись совместно с изониазидом. Разница показателей высеваемости при лечении нанокомпозитом в сравнении с другими группами животных статистически достоверна р < 0,05). Таким образом, по критерию высеваемости МБТ из лёгочной ткани приоритет в лечении принадлежит совместному применению наночастиц серебра и химиопрепарата изониазид, что также свидетельствует о синергизме применяемых компонентов. Повторное исследование лекарственной устойчивости выделенного из лёгочной ткани животных возбудителя соответствовало изначальному спектру резистентности МБТ. D-группа C-группа B-группа A-группа 8 Ï-!-, -^ F 23 і і f 3,6 -é-4-4-4-/ 0 1 2 3 4 Рис. 2. Высеваемость МБТ из лёгочной ткани мышей Динамика гибели мышей Группы Количество мышей Динамика гибели животных Всего погибли Всего выжили Индекс выживаемости, % сроки после заражения 10 дней 20 дней 25 дней 30 дней 35 дней 40 дней 45 дней A 10 - - - 2 6 1 1 10 0 0 B 10 - - - - 3 3 6 4 40 C 20 - - - 4 5 4 - 13 7 35 D 20 - - - - - 1 1 2 18 90 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 1. Наночастицы серебра в эксперименте in vitro продемонстрировали бактерицидное действие на устойчивые к изониазиду штаммы возбудителя туберкулеза в монорежиме в 48,1 % случаев, при сочетанном применении с изониазидом - в 65,3 % (р < 0,05). На МЛУ штаммы МБТ аналогичные показатели составили соответственно 41,7 и 60,5 % (р < 0,05). Полученные результаты свидетельствуют о возможном потенцирующем эффекте наночастиц на изониазид. 2. В эксперименте in vivo макисмальная результативность по критериям выживаемости инфицированных животных и показателю высеваемости МБТ из лёгочной ткани наблюдалась при сочетанном применении наночастиц серебра с изониазидом, при этом к изониазиду возбудитель имел устойчивость. 3. Полученные экспериментальным путем in vitro и in vivo результаты, свидетельствующие о противотуберкулезной активности наночастиц серебра, позволя ют рассматривать их как кандидата в адъюванты химиотерапии лекарственно-устойчивого туберкулеза. ЛИТЕРАТУРА

About the authors

A. V Zaharov

Yaroslavl regional clinical tuberculosis hospital

Email: Yrzahan@mail.ru

A. L Hohlov

FSBEI HE «Yaroslavl state medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

References

Supplementary files