АКТИВНОСТЬ НОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА ОСНОВЕ АЗОЛОАЗИНА НА МОДЕЛЯХ ОЦЕНКИ АНТИГЛИКИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ И ИНГИБИРОВАНИЯ ДПП-4


Цитировать

Полный текст

Аннотация

В результате скрининговых исследований in vitro по поиску возможной антидиабетической активности ряда веществ, производных азолоазина, установлено, что соединения способны к умеренному ингибированию дипепти-дилпептидазы-4 (ДПП-4), подавляя активность фермента в среднем на 60 % в концентрации 100 мкМ, что уступает по силе действия эталонному препарату вилдаглиптину (более 99 % подавления активности ДПП-4 в той же концентрации). Также соединения способны значительно замедлять гликирование бычьего сывороточного альбумина (БСА) (лидер ряда - соединение 1в подавляет реакцию гликирования БСА на 74 % в концентрации 1 мМ, в сравнении с 58 % ингибирования для референтного соединения аминогуанидина). Способности соединений связывать (хелатировать) Cu2+ в тесте аутоокисления аскорбиновой кислоты установить не удалось, за исключением соединения 1к (замедлял реакцию на 49 % в концентрации 40 мкМ, что сопоставимо по активности с референтным препаратом пиоглитазоном, и несколько активнее, чем липоевая кислота). Ограничение для установления медьсвязывающей активности прочих представителей ряда обусловлено высоким светопоглощением на рабочей длине волны 265 нм и не является критерием исключения хелатирующих свойств. Результаты позволяют заключить, что класс соединений является перспективной основой для дальнейшей разработки средств с антигликирующей активностью на основе структур представителей ряда.

Полный текст

Azoloazine, glycation, DPP-4, chelation, copper. Повсеместное распространение сахарного возможности полного излечивания), с потребнодиабета (СД), различные формы которого имеют стью в регулярном контроле гликемии и контроля хроническую гликемию в качестве ведущего симп- развития и течения осложнений основного заботома, является актуальной проблемой здраво- левания [2, 4, 21, 28]. охранения в мире. Основные факты, представ- Инвалидизация и смертность при СД напряленные ВОЗ [2] в открытый доступ, характеризуют мую связаны с сопутствующими диабету осложэпидемиологию СД как стремительно и неуклонно нениями, в частности, сердечно-сосудистыми растущую; глобально распространенную; быстро заболеваниями, офтальмопатией, почечной недопрогрессирующую и социально-зависимую. При статочностью, поражением нервной системы, этом СД характеризуется инвалидизацией; преж- нарушением микроциркуляции крови и т. д. [5, 8, девременной смертностью; курабельностью (без 11, 20]. * Работа по изучению фармакологической активности соединений 1б-1о, рассматриваемых в статье, проведена в рамках финансирования по гранту Российского научного фонда (грант РНФ № 14-25-00139). Работа по синтезу соединений 1б-1о была выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации (грант № 4.6351.2017/8.9). Выпуск 1 (69). 2019 79 :©@@Т0РСЗ Фактором развития данных осложнений является накопление в тканях конечных продуктов гликирования (КПГ) белков, липидов и нуклеиновых кислот. Формирование КПГ обусловлено реакцией неферментативного гликирования (реакцией Майя-ра), а также окислительными процессами [8]. Реакция интенсивно протекает при сопутствующей СД хронической гипергликемии, часто сопровождаясь повышением содержания катионов металлов переходной валентности в средах организма. Лекарственных средств, имеющих в качестве основного механизм ингибирования гликирования и/или инактивацию КПГ, в клинической практике нет, а экспериментальные средства с данной активностью не завершили клинических испытаний (аминогуанидин, алагебриум и др.) [6, 27]. Способность подавлять гликирование пост-фактум обнаруживается у некоторых препаратов, рекомендованных для профилактики/лечения осложнений СД, однако имеющих иные первоначальные показания, не связанные напрямую с гликирова-нием (липоевая кислота при полинейропатии, сар-тановые блокаторы рецепторов к ангиотензину II при нефропатии и т. д.) [16]. Часть этих препаратов, вероятно, реализует свое действие посредством подавления каталитической функции катионов переходных металлов, которые усиливают процесс образования КПГ на многих этапах (образование оснований Шиффа, оксидативная деградация продуктов Амадори и т. д.) [13, 16], часть способна инактивировать образующиеся при гликировании реактивные карбонилы (липоевая кислота и др.). Класс средств, направленных на подавление реакции Майяра, имеет значение при лечении СД всех типов, поскольку гликирование определено не типом диабета, а гликемическим профилем. Кроме ингибиторов реакции гликирования, высоким антидиабетическим потенциалом обладают синтетические сахароснижающие средства. Среди них выделяются получившие распространение в последние два десятилетия препараты с ин-кретиномиметическим действием, к которым относятся ингибиторы ДПП-4. Считается, что инкре-тиномиметики перспективны при СД типа 2. Существуют экспериментальные данные возможной полезности и в условиях инсулинозависимой патологии [12, 15]. Так, лираглутид понижает потребность в инсулине и снижает уровень глики-рованного гемоглобина при СД типа 1. Возможно, положительное действие от их использования реализуется по причине сохранности очень незначительного пула бета-клеток. Таким образом, создание новых лекарственных средств, имеющих один или оба описанных выше механизма действия, является актуальным. В классе веществ, производных нитроазоло-азинов, имеются соединения с разнообразной биологической активностью [19], в числе которой противовирусное [3, 10] и аденозинергическое действия [22], предотвращение септического шока [23]. Ранее, некоторые производные нитразолопи-римидина, аналоги нитратиадиазолов, проявили антигликирующую активность, а некоторые вещества имели потенциал в качестве хелаторов меди (II) [17, 18, 25, 26]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Изучение представителей новых различно-замещенных азолоазинов из класса 5-алкиламино-6-нитро-1 ,3,4-тиадиазоло[3,2-а]пиримидин-7-онов в качестве перспективных средств, способных замедлять формирование поздних осложнений СД и ингибировать ДПП-4. Вещества синтезированы в ФГАОУ ВО «УрФУ имени первого Президента России Б.Н. Ельцина» под руководством Владимира Леонидовича Русинова. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Определение антигликирующей активности in vitro. Реакцию гликирования белков моделировали в реакционной смеси, содержащей глюкозу (500 ммоль/л) и БСА (1 мг/мл) в фосфатном буферном растворе (PBS, рН 7.4). Исследуемые вещества в реакционную среду вносили растворенными в ДМСО (конечная концентрация ДМСО не более 3,2 %). Образцы инкубировали 24 ч при 60 °С. Белок осаждали добавлением ТХУ 100 %, пробы центрифугировали при 15000 g 5 мин. После удаления центрифугата осадок гликированного БСА растворяли в PBS (pH 7.4). Специфическую флуоресценцию конечных продуктов гликирования определяли в 96-луночных черных планшетах (Greiner Fluorotrac 655077) на микропланшетном ридере Infinite M200 PRO (Tecan, Австрия) при Лех 370 нм и Aem 440 нм [25]. Активность рассчитывали по отношению к интенсивности флуоресценции контрольных образцов. В качестве положительного контроля использовали экспериментальный ингибитор неферментативного гликозилирования -аминогуанидин. Определение медь (П)-хелатирующей активности in vitro. Хелатирующую активность соединений исследовали в концентрации соединений 40 мкМ по методике подавления медь-зависимого аутоокисления аскорбиновой кислоты, оценивая величину IC50. Отобранные концентрации ранее определены в ходе предварительной валидации и настройки экспериментальной модели [9, 24]. В качестве контроля использовали липоевую кислоту и пиоглитазон. Растворение соединений осуществляли в DMSO 99 %. Индикатор активности катионов меди (II) - 100 мкМ раствор аскорбиновой кислоты, источник Cu2+ - CuSO4 • 5H2O в конечной концентрации 150 мкМ (95 мкМ в пересчете той же массы на безводную соль). Комплексообразование проводили предварительным смешением и инкубацией в течение 5 мин при 37 °C раствора сульфата меди и исследуемого вещества или DMSO. Смесь вносили в раствор аскорбиновой кислоты. Аутоокисление регистрировали спектрофотометрически (спектрофотометр APEL PD-303 UV) в кювете из кварца низкотемпературной обработки (Л = 265 нм). 80 = Выпуск 1 (69). 2019 :©@@Т0РСЗ Ингибирование ДПП-4. Плазму здоровых добровольцев (40 мкл) инкубировали с l0 мкл раствора исследуемых соединений, с 2,5 % DMSO в 100 мМ Tris-HCl буферного раствора (pH 8.0, 50 мкл) при температуре 37 °С в течение 5 минут. Затем 100 мкл 1 мМ Gly-Pro-p-нитроанилида в виде раствора (Sigma, США) добавляли в реакционную среду и инкубировали при 37 °С в течение 15 минут. Образование p-нитроанилина регистрировали спектрофотометрически при длине волны Л 405 нм [14] (прибор Infinite M200 PRO, Tecan, Австрия). В качестве позитивного контроля использовали вилдаглиптин (Sigma, США) [7]. Ингибиторную активность определяли по формуле: Ингибирование, % = (1 - ДАпроба / ДАконтроль) х 100, где ДАпроба и ДАконтроль соответствуют приросту оптической плотности в тестовом и контрольном образцах соответственно. Статистическая обработка. Все эксперименты выполнены в трех повторениях. Обработка первичных данных проведена в программе GraphPadPrism 7.0 с использованием критерия ANOVA (пост-тест Туке), линейной регрессии, а также нелинейной регрессии. Величина p < 0,05 считалась критерием статистической значимости. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Совокупные данные исследований приведены в таблице. Потенциал противодиабетической активности соединений 1б-о при расчете ингибирующей активности in silico относительно фермента ДПП-4 и антигликирующей активности in vitro Шифр Подавление флуоресценции гликированного БСА in vitro, % (m ± SEM) при концентрации 1000 мкМ IC50, мкМ антигликирования Хелатирование катиона меди (II), % (m ± SEM), 40 мкМ Ингибирование активности ДПП-4, %, (m ± SEM), 100 мкМ 1б 73,9 ± 3,7* 289,8 4,5 ± 5,4 66,0 ± 3,7* 1в 73,9 ± 1,3* 181,2 13,2 ± 3,9 31,1 ± 3,7* 1г 39,4 ± 6,5 - -15,6 ± 6,1 38,8 ± 0,1* 1д 69,6 ± 0,2* 325,1 3,2 ± 1,6 64,0 ± 4,5* 1е 42,4 ± 2,9* - -4,8 ± 7,1 45,8 ± 2,1* 1ж 37,5 ± 4,9* - -19,9 ± 10,2 43,2 ± 2,7* 1з 30,5 ± 6,3* - 12,9 ± 0,9 55,0 ± 9,8* 1и 40,6 ± 4,5* - 9,7 ± 6,1 35,7 ± 0,2* 1к 29,6 ± 3,6* - 49,4 ± 0,9* 27,9 ± 1,0* 1м 76,6 ± 2,7* 166,8 10,6 ± 0,6 42,2 ± 2,3* 1н 12,3 ± 3,5 - 12,8 ± 8,7 44,4 ± 0,5* 1о 71,4 ± 0,5* 208,7 - 38,7 ± 0,4* Аминогуанидин 57,8 ± 0,6* 765,0 - - Липоевая кислота - - 28,1 ± 4,2* - Пиоглитазон - - 58,4 ± 3,1* - Вилдаглиптин - - - 94,7 ± 1,0* * Данные статистически значимы по отношению к отрицательному контролю (ANOVA, пост-тест Туке, p < 0,05). В результате исследований биологической активности соединений установлено, что класс веществ высокоперспективен в качестве основы для создания средства с антигликирующей активностью. Все соединения класса значительно подавляли флуоресценцию проб, что, в соответствии с гипотезой, связано со сниженной продукцией флуоресцирующих КПГ. При этом уровень активности был выше, чем у общепризнанного референта аминогуанидина. Более высокая анти-гликирующая активность отмечена для соединения с терт-бутилом в качестве заместителя (1в). Предположительно, класс веществ перспективен в отношении хелатирования меди (Il), что, однако, основывается на проявленной активности всего одного вещества в ряду, поскольку прочие соединения имели более высокую оптическую плотность при длине волны, используемой для исследования (265 нм). Активность установлена для соединения 1к, значение Ю50 соответствует 29,4 мкМ. Данное соединение по показателю IC50 превзошло референтные препараты пиоглитазон (IC50 44,1) и липоевую кислоту (IC50 68,9) (данные не приведены в таблице). Таким образом, установленная активность одного соединения не может быть однозначным признаком перспективности целого класса, однако отсутствие активности прочих представителей нельзя считать признаком исключения данного действия. Вывод о перспективности класса в отношении связывания меди (II) основан на структурной близости соединений. Также установили, что соединения ряда способны оказывать ингибирующий эффект на активность ДПП-4, однако уровень ингибирования уступает референтному соединению вилдаглиптину. Так, тестируемые соединения подавляют активность фермента в среднем на 60 % в концентрации 100 мкМ (табл.), что, однако, уступает по силе действия эталонному препарату вилдаглиптину (более 99 % подавления активности ДПП-4 в той же концентрации, Ю50 вещества 0,015 мкМ). Для ранее исследованных структурных аналогов рассматриваемого класса соединений была установлена ДПП-4 ингибирующая активность, что является дополнительным свидетельством перспективности класса молекул по описываемому виду активности [1]. :©@@Т0РСЗ ЗАКЛЮЧЕНИЕ Соединения, различнозамещенные азоло-азины из класса 5-алкиламино-6-нитро-1,3,4-тиа-диазоло[3,2^]пиримидин-7-онов, являются перспективной основой для создания препаратов с антигли-кирующим действием, соответствующим или превосходящим по уровню активности экспериментальное антигликирующее соединение аминогуанидин (более 70 % активности для соединений-лидеров и 59 % для аминогуанидина, при концентрации 1000 мкМ). Наибольшая активность отмечена у терт-бутил, гидроксифенил и хлорфенил замещенных представителей. Для одного соединения, имеющего гидроксибутильный заместитель, установлено наличие хелатирующей активности в отношении катионов меди (II) (49 % активности при концентрации 40 мкМ), по уровню сопоставимой с пиоглитазоном (58 % активности при той же концентрации). Соединения обладают умеренной способностью к ингибированию дипептидилпептидазы-4 (в среднем на 60 % при концентрации 100 мкМ), что, однако слабее по уровню активности, чем референт вилдаглиптин (более 99 % активности). ЛИТЕРА ТУРА/REFERENCES
×

Об авторах

Е. В Соколова

ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: info@eco-vector.com
Россия,

Е. А Хохлачева

ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: info@eco-vector.com
Россия,

Д. Д Шамшина

ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: info@eco-vector.com
Россия,

А. Е Батычёк

ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: info@eco-vector.com
Россия,

П. А Радаев

ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: info@eco-vector.com
Россия,

Н. А Прокофьева

ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: info@eco-vector.com
Россия,

Роман Александрович Литвинов

ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: litvinov.volggmu@mail.ru

к. м. н., ассистент кафедры фармакологии и биоинформатики

Россия,

Д. А Бабков

ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: info@eco-vector.com
Россия,

К. В Саватеев

ФГАОУ ВО «УрФУ имени первого Президента России Б.Н. Ельцина»

Email: info@eco-vector.com
Россия,

В. В Федотов

ФГАОУ ВО «УрФУ имени первого Президента России Б.Н. Ельцина»

Автор, ответственный за переписку.
Email: info@eco-vector.com
Россия,

Список литературы

  1. Васильев П.М., Спасов А.А., Чепляева Н.И., Литвинов Р.А. Ингибиторы дипептидилпептидазы-4 Vasil'ev P.M., Spasov A.A., CHeplyaeva N.I., Litvinov R.A. ngibitory dipeptidilpeptidazy-4. Dipeptidyl peptidase-4 inhibitors]. Свидетельство о регистрации базы данных RUS 2015620158, от 12.12.2014.
  2. Сайт Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) [Электронный ресурс] [Sajt Vsemirnoj organizacii zdravoohraneniya (VOZ). World Health Organization (WHO) website]. URL: http://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/ detail/diabetes.
  3. Чупахин О.Н., Чарушин В.Н., Русинов В.Л. Научные основы создания противовирусных и антибактериальных препаратов [CHupahin O.N., CHarushin V.N., Rusinov V.L. Nauchnye osnovy sozdaniya protivovirusnyh i antibakterial'nyh preparatov. Scientific basis for the creation of antiviral and antibacterial drugs] // Вестник Российской академии наук [Vestnik Rossijskoj akademii nauk. Bulletin of the Russian Academy of Sciences]. - 2016. - Т. 86, № 6. - С. 546-552.
  4. Bourne R.R., Stevens G.A., White R.A., Smith J.L., Flaxman S.R., Price H. et al. Causes of vision loss worldwide, 1990-2010: a systematic analysis // Lancet Global Health. - 2013. - Vol. 1 - Article № e339-e349.
  5. Goh S.Y., Cooper M.E. The Role of Advanced Glycation End Products in Progression and Complications of Diabetes // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 2008. - Vol. 93. - № 4. - P. 1143-1152.
  6. Hartog J.W., Willemsen S., van Veldhuisen D.J., Posma J.L., van Wijk L.M., Hummel Y.M., Hillege H.L., Voors A.A. Effects of alagebrium, an advanced glycation endproduct breaker, on exercise tolerance and cardiac function in patients with chronic heart failure // Eur. J. Heart. Fail. - 2011. - Vol. 13 (8). - P. 899-908.
  7. He Y.-L., Flannery B., Campestrini J., Leon S., Zinny M., Ligueros-Saylan M., Jarugula V. Effect of food on the pharmacokinetics of a vildagliptin/metformin (50/1000 mg) fixed-dose combination tablet in healthy volunteers // Curr. Med. Res. Opin. - 2008. - Vol. 24. - P. 1703-1709.
  8. Hellwig M., Henle T. Baking, Ageing, Diabetes: A Short History of the Maillard Reaction // Angew. Chemie Int. Ed. - 2014. - Vol. 53, № 39. - P. 10316-10329.
  9. Ivanov A.A., Shamshina D.D., Litvinov R.A., Batrakov V.V. Optimisation of copper-induced ascorbate autoxidation method using real-time detection. Integrative decision example // Journal of VolSMU. - 2018. - № 2 (66). - P. 47-49.
  10. Karpenko I., Deev S., Kiselev O., Charushin V., Rusinov V., Ulomsky E., Deeva E., Yanvarev D., Ivanov A., Smirnova O., Kochetkov S., Chupakhin O., Kukhanova M. // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. - 2010. - Vol. 54. -Issue 5. - P. 2017-2022.
  11. Kay A.M., Simpson C. L., Stewart J.A. The Role of AGE/RAGE Signaling in Diabetes-Mediated Vascular Calcification // J. Diabetes Res. Hindawi Publishing Corporation. - 2016. - Vol. 2016. - Article ID 6809703.
  12. Kuhadiya N.D., Dhindsa S., Ghanim H., Mehta A., Makdissi A., Batra M., Sandhu S., Hejna J., Green K., Bellini N., Yang M., Chaudhuri A., Dandona P. Addition of Liraglutide to Insulin in Patients With Type 1 Diabetes: A Randomized Placebo-Controlled Clinical Trial of 12 Weeks // Diabetes Care. - 2016. - Vol. 39 (6). - P. 1027-1035.
  13. Lowe J., Taveira da Silva R., Hilario Souza E. D i ssecti n g copper homeostasis in diabetes mellitus // J. IUBMB. - 2017. - Vol. 69. - P. 255-262.
  14. Matheeussen V., Lambeir A.-M., Jungraithmayr W., Gomez N., McEntee K., Van der Veken P., S.Scharpé, De Meester I. Method comparison of dipeptidyl peptidase IV a ctivity ass ays and their application in biological samples containing reversible inhibitors // Clin. Chim. Acta. - 2012. -Vol. 413. - P. 456-462.
  15. Mathieu C., Zinman B., Uddén J. Efficacy and Safety of Liraglutide Added to Insulin Treatment in Type 1 Diabetes: The ADJUNCT ONE Treat-To-Target Randomized Trial. Hemmingsson, Vincent Woo, Peter Colman, Erik Christiansen, Martin Linder, Bruce Bode and for the ADJUNCT ONE Investigators // Diabetes Care. - 2016. - Vol. 2016. - dc160691.
  16. Nagai R., Murray D.B., Metz T.O., Baynes J.W. Chelation: A Fundamental Mechanism of Action of AGE Inhibitors, AGE Breakers, and Other Inhibitors of Diabetes Complications // Diabetes. - 2012. - Vol. 61 (3). - P. 549-559.
  17. Patent RF 2612300, 2017, bull.7.
  18. Patent RF 2641107, 2018, bull. 2.
  19. Rusinov V.L., Charushin V.N., Chupakhin O.N. Biologically active azolo-1,2,4-triazines and azolopyrimidines // Russian Chemical Bulletin. - 2018. - Vol. 67. - № 4. - P. 573-599.
  20. Salahuddin P., Rabbani G., Khan R. The role of advanced glycation end products in various types of neurodegenerative disease: a therapeutic approach // Cell. Mol. Biol. Lett. - 2014. - Vol. 19. - № 3.
  21. Sarwar N., Gao P., Seshasai S.R., Gobin R., Kaptoge S., Di Angelantonio et al. Diabetes mellitus, fasting blood glucose concentration, and risk of vascular disease: a collaborative meta-analysis of 102 prospective studies. Emerging Risk Factors Collaboration // Lancet. - 2010. -Vol. 375. - P. 2215-2222.
  22. Savateev K.V., Ulomsky E.N., IButorin I., Charushin V.N., Rusinov V.L., Chupakhin O.N. Azoloazines as A2a receptor antagonists. Structure and properties // Russ. Chem. Rev. - 2018. - Vol. 87 (7). - P. 636-669.
  23. Savateev K.V., Ulomsky E.N., Fedotov V.V., Rusinov V.L., Sivak K.V., Lyubishin M.M., Kuzmich N.N., Aleksandrov A.G // Russian Journal of Bioorganic Chemistry. - 2017. - Vol. 43. - Issue 4. - P. 421-428.
  24. Shamshina D.D., Litvinov R.A. Validation of the ascorbic acid autoxydation metod (copper-induced) as a metod for estimation of evaluation of activity of compounds connecting d-elements // Journal of VolSMU. - 2018. - №1 (65). - P. 115-117.
  25. Spasov A.A., Babkov D.A., Sysoeva V.A., Litvinov R.A., Shamshina D.D., Ulomsky E.N., Savateev K.V., Fedotov V.V., Slepukhin P.A., Chupakhin O.N., Charushin V.N., Rusinov V.L. // Archiv der Pharmazie. - 2017. -Vol. 350. - Article № 1700226.
  26. Spasov A.A., Zhukovskaya O.N., Brigadirova A.A., Abbas H.S.A., Anisimova V.A., Sysoeva V.A., Rashchenko A.I., Litvinov R.A., Mayka O.Yu., Babkov D.A., Morkovnikc A.S. Synthesis and pharmacological activity o f 2 ( biphenyl4yl)imidazo[1,2a]benzimidazoles // Russian Chemical Bulletin. - 2017. - Vol. 66. - № 10. - P. 1905-1912.
  27. Thornalley P.J. Use of aminoguanidine (Pimagedine) to prevent the formation of advanced glycation endproducts // Arch. Biochem. Biophys. - 2003. - Vol. 419 (1). - P. 31-40.
  28. 2014 USRDS annual data report: Epidemiology of kidney disease in the United States. United States Renal Data System. National Institutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, Bethesda, MD. - 2014. - P. 188-210.

Дополнительные файлы

Доп. файлы
Действие
1. JATS XML
Скачать

© Соколова Е.В., Хохлачева Е.А., Шамшина Д.Д., Батычёк А.Е., Радаев П.А., Прокофьева Н.А., Литвинов Р.А., Бабков Д.А., Саватеев К.В., Федотов В.В., 2019

Creative Commons License
Эта статья доступна по лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 79562 от 27.11.2020 г.

Данный сайт использует cookie-файлы

Продолжая использовать наш сайт, вы даете согласие на обработку файлов cookie, которые обеспечивают правильную работу сайта.

О куки-файлах