MORPHOFUNCTIONAL PROPERTIES OF THE RATS BLOOD CELLS IN THE DEVELOPMENT OF EXPERIMENTALLY INDUCED ESTROGEN-DEPENDENT OVARIAN TUMORS

Full Text

Hormone-dependent ovarian tumor, blood shaped elements, atomic force microscopy, confocal laser scanning microscopy, microrelief, elasticity. Одной из ключевых задач современной клеточной биологии является изучение механизмов межклеточного взаимодействия в условиях опухолевого роста в организме. Известно, что рост новообразований зависит от степени развитости в них сосудистой системы. В ряде экспериментальных работ представлены данные о том, что эндотелиальные клетки микрососудов выделяют в экстрацеллюлярный матрикс опухолевых образований ряд факторов роста (например, фактор роста фибробластов и тромбоцитов, инсулиноподобный фактор роста, гепаринсвязанный эпителиальный фактор роста, интерлейкины) [8]. Причем установлена достоверная разница в количестве и плотности внутриопухолевых сосудов в злокачественных эпителиальных опухолях яичников по сравнению с доброкачественными вариантами [7]. Однако механизмы супрамолекулярного и клеточного взаимодействия между опухолевыми клетками и форменными элементами крови остаются практически неизученными, что не позволяет пока создать единую концепцию опухолевого роста и объективно изучить степень вовлечения в этот процесс системы крови. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Изучение морфофункциональных свойств форменных элементов крови крыс в условиях моделирования экспериментальных эстрогензависимых опухолей. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Экспериментальная часть работы выполнена на 30 беспородных лабораторных половозрелых (3 месяца) самок крысы серой (Rattus norvegicus). :©@@Т0РСЗ Работа проведена с соблюдением требований Хельсинкской декларации по гуманному обращению с животными. Крыс содержали в виварии в контролируемых условиях окружающей среды при температуре 18-20 °С и относительной влажности воздуха 30-70 %. В комнатах содержания соблюдали 12 часовой цикл освещения «день-ночь» и не менее чем 11- кратную смену объема воздуха в час, концентрация CO2 не более 0,15 объемных %, аммиака не более 0,001 мг/л. Животные получали стандартный пищевой рацион (ПК-120-1) и воду, соответствующую ГОСТу «Вода питьевая» 2874-82. Вес животных на начало эксперимента составлял 100-120 г. По истечении периода адаптации формировали опытную и контрольную группы по 15 особей в каждой. Животных по группам распределяли рандоми-зированно, с использованием в качестве основного критерия массу тела, так, чтобы различия по этому показателю между особями не превышали 10 %. Модель эстрогениндуцированных опухолей яичников создавали путем введения ^-эстрадиола (эстрон), под торговым названием фолликулин. В проведенном исследовании использовали масляный раствор эстрона, 1 мл которого содержал в пересчете на 100 % сухого вещества 1 мг эстра-1,3,5-(10)триен-17-он. Гормон вводили животным опытной группы внутрибрюшинно в концентрации 0,6 Ед/день в течение 14 дней. Объем одной инъекции составлял 0,1 мл, содержащий 6 Ед активного действующего вещества [1]. Параллельно контрольной группе животных вводили 0,1 мл физраствора. Создаваемая экспериментальная модель индукции опухолевых клеток основана на литературных данных с учетом доз эстрадиола 0,2 мкг/день, 0,02 мкг/день и 2 мкг/день, которые обладают эндокринным и генотоксическим эффектом у оварэктоми-рованных крыс [2]. В ходе проведения эксперимента контролировали процесс опухолевого перерождения яичников, используя гистологические срезы яичников. Гистологические препараты яичников готовили общепринятыми способами. Заливку материала осуществляли в парафин, срезы, толщиной 5 мкм, готовили на микротоме, окраску проводили с использованием гематоксилина-эозина. Анализ срезов яичников выполнен на анализаторе изображений «ВидеоТест». Морфофункциональные свойства форменных элементов крови изучали в условиях ex vivo. Забор крови проводили через 30 дней от начала исследования. Кровь брали у предварительно наркотизированных животных, непосредственно из сосудов, питающих опухоль. В качестве антикоагулянта использовали гепарин в количестве 20 Ед/мл. Проводили разделение проб крови на лейкоциты и эритроциты. Кровь центрифугировали 10 мин при 1500 об./мин, собирали нижнюю часть плазмы, богатую лейкоцитами, и лейкоцитарное кольцо. Примесь эритроцитов разрушали 0,83%-м раствором хлорида аммония. Лейкоциты дважды отмывали изотоничным буферным раствором (раствор Дульбекко, рН = 7,4). Эритроциты также отмывали и ресуспендировали в изотоничном буферном растворе. С целью сохранения жизнеспособности клеток перед сканированием их помещали во вл ажную камеру [6]. Сканирование проводили методом аСм в полуконтактном режиме на СЗМ Интегра Вита (Зеленоград, Россия, 2009), используя кан-тилеверы серии NSG03 с радиусом закругления зонда до 10 нм. Сканировали по 20 клеток из каждой пробы. На основе полученных сканов строили кривые профиля участков поверхности, на которых измеряли геометрические параметры клеток (диаметр, высоту, площадь поверхности, объем), используя программное обеспечение Nova. Жесткость форменных элементов крови исследовали в режиме силовой спектроскопии (АСС) [5]. Силовую нагрузку на клетки накладывали в 25 стандартных точках клеточной поверхности. По полученным данным строили карты наноидентирования, используя программное обеспечение «Ef3». Учитывая генотоксический и пролиферативные эффекты эстрогенов, обуславливающие их вовлечение в процесс канцерогенеза, необходимым этапом в проведенном исследовании была оценка жизнеспособности клеток крови в условиях развития опухоли. С целью оценки цитотоксичности эстрогенов применяли флюоресцентный метод анализа жизнеспособности клеток крови с двойным окрашиванием - этидиум бромидом (Helicon, USA) и ацетооксиметиловым эфиром кальцеина (Fluka, Switzerland). Использовали стоковые растворы красителей согласно инструкции производителя, из которых готовили рабочий раствор: 4 jM этидиум бромида и 2 |jM ацетооксиметилового эфира кальцеина растворяли в 1,5 ml раствора Дульбекко (ПанЭко, Россия). К 100 мкл суспензии клеток, находящихся в среде 199 (ПанЭко, Россия), добавляли 10 мкл двухкомпонентного флуоресцентного раствора красителей и инкубировали при 37 °С в течение 30 мин. По истечении времени инкубации 100 мкл клеточной суспензии наносили на покровные стекла (25 * 25 мм), дважды отмывали от красителя и компонентов среды в фосфатносолевом буферном растворе. Сканирование клеточных суспензий осуществляли на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе Nikon DIGITAL ECLIPSE C1 plus (Япония, 2012). На полученных сканах подсчитывали количество живых (зеленая флуоресценция в цитоплазме) и мертвых клеток (красная флуоресценция в ядре) на каждые 100 клеток. Жизнеспособность клеток (%) рассчитывали по формуле [9]: N R =-n- *100 , Nn + Nd где R - жизнеспособность клеток, %; Nn - количество живых клеток; Nd - количество мертвых клеток. 92 = Выпуск 1 (69). 2019 :©@@Т0РСЗ Полученные экспериментальные данные обработаны методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Развитие опухолевых перерождений яичников наблюдали через 28 дней от начала инъекций у 33 % животных экспериментальной группы, из них в 20 % случае установлено образование гранулезо-клеточных опухолей и в 13 % случаев - тека-клеточных типов. Гранулезоклеточная опухоль (фолликулома) представляла собой плотноэластическую опухоль с гладкой или бугристой поверхностью, иногда с мелкими кистами и очагами размягчения. В гистологических препаратах гранулезоклеточной опухоли видны поля, тяжи и розетки из зернистых (гран ул езных) клеток, отделенных от стромы (рис. 1а). В препаратах обнаружены клетки призматического и кубического эпителия с округлыми или удлиненными нормохромными ядрами. Цитоплазма у некоторых клеток отсутствует, но там, где сохранилась, она базофильно окрашена, умеренно развита с четкими контурами, часто содержит мелкие гранулы. Располагаются клетки комплексами, тяжами и небольшими розеткоподобными группами. Некоторые клетки располагаются разрозненно. Рис. 1. Гистологический срез гранулезоклеточной опухоли (а) и текаклеточной опухоли (б) яичника крысы. Увеличение Х400 Тека-клеточная опухоль овоидной формы, плотноэластической консистенции. На гистологических препаратах видны переплетающиеся пучки клеток, фибробластоподобной формы, либо эпи-телиоподобной формы (рис. 1б). В препаратах клетки представлены разроз-нено-расположенными голыми ядрами округлой или округло-удлиненной формы. Ядра многих клеток изогнуты, треугольной и неправильной формы с зазубринами. Цитоплазма клеток вытянута, заострена на полюсах, без специфических включений. Установлено, что развитие опухоли в организме спровоцировало увеличение числа погибших лейкоцитов на 270,8 % (р < 0,05) и снижение количества функционально полноценных клеток на 24,4 % (р < 0,05) по сравнению с контрольной группой (рис. 2). Рис. 2. Жизнеспособность лейкоцитов (%) 1-й контрольной и 2-й опытной группы крыс :©@@Т0РСЗ В популяции форменных элементов крови, взятых из сосудов, питающих опухоль, были зафиксированы структурные неоднородности поверхности микрорельефа. В эритроцитах наблюдали утрату центрального просветления и наличие эхиноцитарной формы клеток. Выраженных различий в морфометрических параметрах эритроцитов между опытной и контрольной группами не выявлено (табл.). Не исключено, что изменения в морфологии нейтрофилов связаны с особенностями их локомоторной функции. По данным литературы при развитии опухолей в организме происходит изменение хемотаксической активности нейтрофилов, обусловленное продукцией низкомолекулярных факторов опухолевого перерождения, которые воздействуют на рецепторный аппарат клетки [3]. В рельефе поверхности лимфоцитов характерных особенностей при развитии опухолей не выявлено. Лимфоцитам было свойственно увеличение диаметра клеток 11,7 % (р < 0,05) на фоне снижения их высоты на 12,8 % (р < 0,05), при этом площадь поверхности возросла на 43,6 % (р < 0,05) по сравнению с контролем. В группе опытных животных установлена ярко выраженная реакция распластывания лимфоцитов, что вероятно связано с дефектами в структуре цитоскелета [4]. Диапазон значений упругости клеток крови при развитии опухолевого процесса существенно расширялся от 10 до 30 Па, в то время как в контроле он находился в пределах 12-17 Па. Функционально активной была поверхность лимфоцитов и нейтрофилов. По данным АСС установлено снижение упругости лимфоцитов во всех точках наноидентирования в группе опытных животных. Снижение упругости в лимфоцитах по краю клетки на 42,7 % (р < 0,05) в группе крыс из экспериментальной группы свидетельствует о его лидерстве в механизмах направленной миграции к очагам иммунных реакций. Модуль упругости поверхности нейтрофилов крыс опытной группы увеличился по краю клетки В нейтрофилах опытной группы животных наблюдали сглаживание рельефа поверхности и уменьшение числа гранул. Анализируя морфометрические параметры нейтрофилов в опытной группе животных, установили снижение объема нейтрофилов на 56,4 % (р < 0,05), на фоне незначительного возрастания площади поверхности. в области гликокаликса на 107,4 % (р < 0,05), а также в области сегмента ядра, что указывает на повышение их способности адгезировать к сосудистой стенке. По данным литературы нейтро-филы первыми (на 10-е сутки после инокуляции опухолевых клеток) мигрируют к опухоли на ранних стадиях ее формирования [10], инфильтруют очаги опухолевого роста и становятся активными компонентами стромы [9]. Упругость поверхности эритроцитов опытной группы животных увеличилась во всех точках наноидентирования. По периферии эритроцита упругость возросла на 53,3 % (р < 0,05), а в области центрального углубления - на 59,2 % (р < 0,05) по сравнению с контролем, что может быть связано с их активным участием в транспортных процессах и переносом на своей поверхности иммунных комплексов. Кроме того, одной из причин увеличения упругости мембран клеток крови, при злокачественном росте может быть изменение состава сфинголипидов, существенно влияющих на структуру липидного бислоя мембран. Уменьшение м олярного соотношения церамиды/ганглиозиды показано при опухолях яичников [7]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, функционально ведущими популяциями, отражающими развитие неопластических процессов в организме, являются лимфоциты и нейтрофилы. Упругость клеточной поверхности является диагностическим признаком ранних изменений в организме при развитии опухоли. Морфометрические параметры форменных элементов крови крыс Группы D, мкм Н, мкм V, мкм3 S, мкм2 Эритроциты Контроль 5,67 ± 0,05 0,58 ± 0,01 20,96 ± 0,70 39,54 ± 1,53 Опыт 5,67 ± 0,08 0,58 ± 0,01 20,97 ± 0,65 43,48 ± 1,32 Нейтрофилы Контроль 10,15 ± 0,25 0,69 ± 0,05 61,34 ± 9,32 99,37 ± 9,4 Опыт 9,49 ± 0,22 0,60 ± 0,07 39,21 ± 4,81* 107,88 ± 7,13 Лимфоциты Контроль 6,89 ± 0,08 0,86 ± 0,04 27,20 ± 1,55 54,94 ± 3,07 Опыт 7,70 ± 0,24* 0,75 ± 0,01* 39,07 ± 2,21* 53,81 ± 2,17 * Статистическая значимость достоверности различий клеток крови в опытной группе животных по сравнению с данными в контрольной группе при р < 0,05. Примечание. D - диаметр; H - высота; V - объем; S - площадь поверхности. (І@@Т0РСЗ (ЩСШЇіГіМ^ Расширение диапазона упругости поверхности клеток крови является маркером ранних изменений в организме сопровождающих развитие опухолевого перерождения тканей. Изменение геометрических параметров и «рисунка» рельефа поверхности клеток крови не является надежным диагностическим критерием, отражающим развитие опухолевого процесса в организме. ЛИТЕРАТУРА

About the authors

E. A Sladkova

FSAEI HE «Belgorod State National Research University», Medical Institute

Email: sladkova@bsu.edu.ru

к. б. н., доцент кафедры биохимии медицинского института

Russian Federation,

M. Yu Skorkina

FSAEI HE «Belgorod State National Research University», Medical Institute

Email: info@eco-vector.com

кафедра биохимии

Russian Federation,

N. I Zhernakova

FSAEI HE «Belgorod State National Research University», Medical Institute

Email: info@eco-vector.com

кафедра семейной медицины

Russian Federation,

V. N Dmitriev

FSAEI HE «Belgorod State National Research University», Medical Institute

Email: info@eco-vector.com

кафедра факультетской хирургии

Russian Federation,

E. V Zhernakov

FSAEI HE «Belgorod State National Research University», Medical Institute

Author for correspondence.
Email: info@eco-vector.com

кафедра акушерства и гинекологии

Russian Federation,

References

Supplementary files