A MODIFIED METHOD FOR STUDYING THE GLYCOXIDATION REACTION

Full Text

Сахарный диабет (СД) остается одной из значимых медико-социальных проблем. В мире насчитывается 463 000000 людей с СД [5]. Одной из значимых причин, ограничивающих качество жизни и повышающих риск смерти при СД, являются поздние осложнения (ПОСД), развивающиеся даже на фоне гликемического контроля, отвечающего требованиям стандартов качества [6]. Многие лекарственные средства, применяемые с целью лечения ПОСД, не учитывают их молекулярно-биологический патогенез, в котором значительная роль отведена образованию конечных продуктов (КПГ) и их действию на организм [12, 13]. В доклинических исследованиях новых анти-гликирующих соединениях на скрининговом этапе наиболее часто применяется тест-система оценки антигликирующей активности, основанная на глики-ровании бычьего сывороточного альбумина (БСА) в фосфатном буферном растворе при рН 7.4. Процесс образования КПГ многостадийный, протекает по множеству механизмов (реакции, зависимые и независимые от окисления, протекающие при различных рН среды, зависимые от активности металлов переходного ряда [3]). Учитывая условия распространенной модели, можно полагать, что не все из реакций образования КПГ в ней будут в полной мере реализованы. В частности, гликирование, протекающее в окислительной среде в присутствии катионов меди, именуется гликоксидацией [8]. Гликоксидация протекает по дополнительным механизмам, связанным с реакцией Фентон, ускоренным образованием реактивного ациклического иона иминия при протекании перегруппировки Амадори, ускорением процесса аутоокисления гликоальдегида до глиоксаля и др. [3]. Настоящая работа посвящена описанию модификации распространенной модели гликиро-вания с целью настройки на ее основе методики гликоксидации и валидации этой модели. Предлагается к проверке гипотеза о том, что присутствие катионов меди в реакционной среде может не просто потенцировать образование КПГ, но и иметь решающее значение при протекании реакции гликоксидации. Разработка, представленная в статье, позволит повысить эффективность скринингового этапа при поиске новых соединений. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Настройка и валидация метода гликоксида-ции бычьего сывороточного альбумина глюкозой в присутствии CuSO4*5H2O МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Экспериментальная процедура В основу модели положена методика реакции гликирования БСА глюкозой в фосфатном буферном растворе. Исходная методика многократно использована коллективом авторов и описана [9, 7, 1, 10]. Модификация проведена с опорой на данные литературы [11]. Суть модификации. Проведены следующие изменения относительно исходных условий протекания реакции: 1. Устранено действие фосфат-анионов. Соли фосфатного буферного раствора не используются по причине быстрого реагирования компонентов с источником катионов меди -CuSO4*5H2O. Также исключаются реакции, обусловленные каталитической активностью фосфат-анионов. В качестве буферного агента используется HEPES. 2. Нейтральная рН среды (7,4) заменена на кислую (5,8). Кислая реакция среды, создаваемая HEPES, замедляет нуклеофильное присоединение. 3. Присутствуют низкие концентрации CuSO4* 5H2O. Предполагается, что катионы Cu2+ позволяют обойти энергетический барьер при реакции нуклеофильного присоединения в кислой среде, обеспечивая протекание реакции через формирование промежуточного комплекса. Кроме того, катионы катализируют металл-зависимые реакции при глики-ровании и способствуют образованию АФК. 4. В качестве растворителей для потенциальных новых соединений, активность которых будет изучена на данной модели, может быть использована исключительно деионизированная вода. В исходной тест-системе реакции гликирования в фосфатном буферном растворе в качестве растворителя для соединений часто используется диметилсульфоксид (ДМСО, конечная концентрация 3 %), однако, учитывая его антирадикальную и хелатирующую активности, в данной модификации он неприменим. Нами оценено влияние ДМСО на процесс гликоксидации при описанных выше экспериментальных условиях (данные не представлены). Установлено, что ДМСО инактивирует реакцию, устраняет концентрационно-зависимые различия между подгруппами, содержащими CuSO4*5H2O в разных концентрациях. Описание методики. Субстрат гликирования: БСА (1 мг/мл); индуктор гликирования: глюкоза (0,5 М); среда протекания реакции: HEPES-буферный раствор (2,4 г на 100 мл, рН 5,8), с различным содержанием CuSO4*5H2O (0, 5, 10 или 15 мг/л); условия протекания реакции: температура 60 °С; длительность инкубации: 24 часа. Растворение всех реагентов производили с применением деионизированной воды (деионизатор Prodeion 10 VS). После постановки реакции гликоксидации БСА осаждали при помощи трихлоруксусной кислоты (конечная концентрация 10 %) и центрифугирования (15 000 rpm, 4 °С, 4 мин) (центрифуга Sigma, Япония). Жидкую фракцию аспирировали. Осадок растворяли в фосфатном буферном растворе (рН 10,5). Аликвоты раствора вносили в 96-луночный планшет (GreinerFlatBlack, 96), определяли флуоресценцию КПГ на длинах волн возбуждения/испускания 370440 нм соответственно на микропланшетном ридере (Infinite 220 Pro, TECAN, Австрия). Подтверждение действительного участия катионов меди как определяющего фактора при протекании реакции Для проверки гипотезы о действительности вклада катионов меди (II) в образование КПГ сформирован алгоритм: 1) визуальный анализ по всем подгруппам количественных признаков на основе частотного распределения данных в подгруппах (Statistica 12, «Correspondence Analysis»); 2) кластеризация всего массива данных для оценки группируемости данных по подгруппам согласно их фактической принадлежности и присвоение категориального значения класса каждой непрерывной величине в подгруппах (Statistica 12, «k-Means Cluster Analysis»); 3) анализ таблиц частот при помощи критерия Хи-квадрат для подтверждения статистической значимости изменения величины значений между подгруппами; 4) проверка законов распределений количественных признаков в отдельных подгруппах и определение их значений (оценка групповым средним, медианам, дисперсии), для аргументации использования критериев сравнения данных (GraphPad Prism 7.0, критерии при оценке распределения данных: критерий Колмогорова - Смирнова, критерий Пирсона, критерий Шапиро - Уилка; критерии при межгрупповом сравнительном анализе: критерий Краскела - Уоллиса, пост-тест Данна, p < 0,05); 5) регрессионный анализ данных и установление аналитического диапазона, в котором зависимость продукции КПГ от концентрации CuSO4*5H2O может быть описана линейной функцией (Microsoft Excel 2007, линейный регрессионный анализ). Валидация экспериментальной процедуры При валидации посчитаны и проанализированы следующие параметры: среднее значение (M), стандартное отклонение (SD), относительное стандартное отклонение (RSD%), доверительный интервал среднего (С/), согласно ранее опубликованным данным [2]. Операции выполняли в пакете программ GraphPad Prism7.0, Statistica 12 и MicroSoftExcel 2007. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Подтверждение значимости катионов меди как определяющего фактора образования КПГ Исследование провели согласно описанной экспериментальной процедуре. Был получен набор данных о влиянии трех разных концентраций CuSO4*5H2O, а также отсутствия таковой на образование флуоресцирующих КПГ (табл. 1). Визуальный анализ частотного распределения данных в подгруппах Визуальный анализ проведен посредством оценки частотного распределения данных в каждой подгруппе (Statistica 12, «Correspondence Analysis»). В качестве граничных значений при проведении частотного анализа приняты значения бинарных центров, соответствующие уровню флуоресценции 800 (нижняя граница) и 3800 (верхняя граница), превосходящие на 1 расстояние между бинарными центрами экстремальные значения по всей совокупности данных. Шаг между бинарными центрами соответствовал 200 условным единицам флуоресценции (табл. 1). В группе, где катионы меди отсутствовали, значения флуоресценции группировались вокруг бинарных центров с низким значением флуоресценции КПГ. Увеличение концентрации катионов влекло визуально определяемое повышение уровня флуоресценции. Это позволяет сделать первичное предположение о зависимости скорости реакции гликирования от содержания переходного металла. Отмечено, что концентрация CuSO4*5H2O свыше 10 мг/л не производит эффекта, отличного от такового для 10 мг/л. Статистическое описание выборок данных представлено в табл. 1. Таблица 1 Фактические значения, частотный анализ и математическое описание данных об уровнях флуоресценции в пробах, содержащих различные концентрации CuSO4*5H2O для каждой подгруппы Показатели Концентрация CuSO4*5H2O, мг/л 0 5 10 15 Номер пробы 1 1499 2247 2695 2841 2 1536 2082 3246 2128 3 1861 2208 2754 2105 4 1470 3064 2371 1715 5 931 1871 3608 2315 6 2135 2187 2327 2374 7 1230 2106 2560 2858 8 1330 2209 2750 2367 9 1286 2058 2368 2349 10 1530 2302 3100 2438 11 919 2117 2497 2277 12 1121 2150 2260 2405 13 1177 2194 2333 2395 14 1465 1910 2294 2311 15 1337 2082 3119 3508 16 1266 2238 2506 2056 17 975 2077 2363 2467 18 1544 2272 2603 2448 19 1369 2266 2314 2635 20 1553 2219 2658 2494 Бинарный центр 800 0 0 0 0 1000 3 0 0 0 1200 5 0 0 0 1400 6 0 0 0 1600 4 0 0 0 1800 1 1 0 1 2000 0 5 0 1 2200 1 12 2 3 2400 0 1 7 11 2600 0 0 5 1 2800 0 0 2 2 3000 0 1 0 0 3200 0 0 3 0 3400 0 0 0 0 3600 0 0 1 1 3800 0 0 0 0 Параметр Медиана 1353,0 2190,5 2533,0 2384,5 Среднее арифметическое 1376,7 2193,0 2636,3 2424,3 Стандартная девиация 296,4 234,4 370,3 361,0 Стандартная ошибка среднего 66,3 52,4 82,8 80,7 Нижний 95%-й доверительный интервал среднего 1238,0 2083,3 2463,0 2255,4 Верхний 95%-й доверительный интервал среднего 1515,4 2302,6 2809,6 2593,2 Кластерный анализ всей выборки для оценки группируемости данных С целью проверки гипотезы о статистической значимости фактора присутствия катионов меди при образовании КПГ проведен кластерный анализ всего массива данных методом k-средних (Statistica 12, утилита «k-Means Cluster Analysis»). Уровни флуоресценции кластеризованы на 4 класса: «0» - минимальный уровень, «1» - низкий уровень, «2» - высокий уровень, «3» - максимальный уровень. Данные проанализированы статистически с применением критерия Хи-квадрат. Установлено наличие статистически значимых различий (степень свободы 73.76, 9; уровень значимости p < 0,0001). Это может быть интерпретировано как статистически значимый прирост уровня флуоресцирующих КПГ от подгруппы данных к подгруппе. Данные о распределении частот представлены в табл. 2. Таблица 2 Распределение частот встречаемости категориальных значений классов при анализе критерием Хи-квадрат Класс Концентрация CuSO4*5H2O, мг/л 0 5 10 15 0 11 0 0 0 1 8 2 0 1 2 1 17 12 16 3 0 1 8 3 Распределение количественных признаков в отдельных подгруппах, выявление статистических различий между подгруппами, проверка линейности Посредством анализа распределения данных в подгруппах (критерий Колмогорова - Смирнова, критерий Пирсона, критерий Шапиро - Уилка) установлено, что не все группы соответствуют нормальному распределению (первое ограничение к применению ANOVA). Единственная подгруппа, отвечавшая требованию нормальности распределения по результату всех трех тестов -подгруппа «0 мг/л». Кроме того, наблюдается неравенство дисперсий генеральной совокупности между выборками с концентрациями 5, 10 и 15 мг/л (второе ограничение к применению ANOVA). Требуется сравнительный анализ выборок с ненормальным распределением данных при неравенстве дисперсий. Обработка межгрупповых различий проведена с применением критерия Краскела - Уоллиса и пост-тестом Данна. Согласно данным литературы [4], условия применения теста следующие: 1. Все выборки являются случайными выборками из соответствующих им популяций. 2. В дополнение к независимости в каждом образце существует взаимная независимость между различными образцами. 3. Шкала измерения как минимум порядковая. 4. Либо функции распределения k-популяции идентичны, либо некоторые из популяций имеют тенденцию давать большие значения, чем другие популяции. Характеристики гипотез данного теста: 1. Все функции распределения k-популяции идентичны. 2. Как минимум одна из популяций имеет тенденцию давать большие наблюдения, чем, по крайней мере, одна из популяций. Таким образом, очевидное и оформленное условие к необходимости равенства дисперсий отсутствует, при этом тест является непараметрическим. Результат представлен на рис. А. зоосн a ZOOOо. О >» С. 6- 1шо" НИ 0--^-1-^-1- Концентрация СиЗО-г бНзО А Концентрация CuS04*5H20 Б Рис. А - статистическое сравнение данных между подгруппами (критерий Краскела - Уоллиса, пост-тест Данна, p < 0,05); Б - линейность данных аналитического диапазона Представленные данные показывают, что имеются статистически значимые различия ряда данных «0 мг/л» с рядами данных «5 мг/л» и «10 мг/л», степень различий которых увеличивается по мере увеличения концентрации CuSO4*5H2O. Концентрация CuSO4*5H2O 15 мг/л производила эффект, не отличимый от такового для концентрации 10 мг/л. Таким образом, границы 0-10 мг/л являются краевыми точками аналитического диапазона. При проверке линейности установлено, что значения средних от выборок данных по концентрациям 0, 5 и 10 мг/л апроксимируются на линию с высоким значением коэффициента детерминации R2 = 0,971 (рис. Б). Учитывая, что значение флуоресценции КПГ в концентрации CuSO4*5H2O 10 мг/л является максимальным и находится на линейном диапазоне, концентрация 10 мг/л отобрана для дальнейшей процедуры валидации посредством определения показателей сходимости и внутрилабораторной воспроизводимости. Определение точности методики Точность методики оценена по показателям сходимости и внутрилабораторной воспроизводимости. Сходимость Сходимость методики была доказана в ходе двух серий по 6 повторностей. Сходимость оценена при следующих условиях: 1) работает один исследователь на одном приборе; 2) используется один метод исследования, реагенты, объект исследования; 3) исследования разделены во времени небольшим промежутком; 4) исследования проводятся в одной лаборатории. Результаты оценки представлены в табл. 3. Таблица 3 Показатели теста гликоксидации БСА глюкозой в оценке сходимости Номер повторности Значения серия 1 серия 2 1 2124 2432 2 2265 2244 3 2248 2420 4 2435 2242 5 2187 2487 6 2159 2367 Среднее арифм. 2236,3 2365,3 SD 110,9 102,2 RSD% 4,96 4,30 Методика считается сходимой, поскольку RSD%, полученное в каждой серии, не превышает целевой величины 5 % для каждой серии проб. Внутрилабораторная воспроизводимость Внутрилабораторная воспроизводимость методики оценивалась по результатам 16 измерений, полученных двумя аналитиками в два разных дня работы. Внутрилабораторная воспроизводимость определена при следующих условиях: 1) работают разные исследователи; 2) используется одна методика; 3) используется идентичный объект исследования и реагенты. Показатель выражается как RSD%. Условное значение соответствовало <5 %. Результаты представлены в табл. 4. Таблица 4 Показатели теста гликоксидации БСА глюкозой в оценке внутрилабораторной воспроизводимости День Аналитик Значения ДЕНЬ 1 Аналитик 1 2290 2470 2482 2538 Аналитик 2 2204 2168 2396 2490 ДЕНЬ 2 Аналитик 1 2288 2312 2416 2232 Аналитик 2 2219 2325 2273 2248 Среднее арифм. 2334,4 SD 115,7 RSD% 4,96 Показатель RSD% составляет величину меньше 5 %. Методику можно считать воспроизводимой. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 1. В результате проделанной работы были настроены условия проведения реакции гликокси-дации, при которых фактор концентрации катионов меди (II) определяет интенсивность образования КПГ. 2. CuSO4*5H2O линейно усиливает образование КПГ в реакции гликоксидации в концентрациях до 10 мг/л. Концентрация 10 мг/л определена как максимально эффективная. 3. Для данной концентрации CuSO4*5H2O методика валидирована по показателям сходимости (RSD% <5 % для двух серий) и воспроизводимости (RSD% 4,96, <5 %). Таким образом, методика может считаться точной, пригодной для применения в научно-исследовательской деятельности.

About the authors

R. A Litvinov

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

Email: litvinov.volggmu@mail.ru

V. A Kosolapov

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

E. A Muravyova

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

I. V. Skachko

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

D. D Shamshina

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

References

Supplementary files