ANALYSIS OF INTERACTION OF THE DIAZEPINO[1,2- a]BENZIMIDAZOLE DERIVATIVE COMPOUND DAB-21 WITH THE MAIN NEUROMEDIATOR SYSTEMS LIGANDS

Full Text

Ввиду большого разнообразия спектров фармакологической активности привилегированных подструктур, входящих в состав изучаемой субстанции, становится очевидна необходимость проведения фармакологического анализа соединения на возможность проявления различных нейромедиаторных взаимодействий. В ранее проведенных исследованиях была показана перспективная анксиолитическая и антидепрессивная активности производного диазепино[1,2-а] бензимидазола под шифром ДАБ-21 [2, 4]. Для производных диазепина характерны выраженные нейропсихотропные свойства, в то время как для бензимидазолов отмечены противомигренозные, психостимулирующие, противосудорожные и многие другие фармакологические эффекты [3]. выходов мышей в открытый рукав, общее число переходов, число свешиваний и болюсов. Для выявления неспецифического катехоламинер-гического действия ДАБ-21 применен тест «Фенами-новая стереотипия»: 1) контрольная группа мышей получала фенамин (5 мг/кг, в/б); 2) опытная группа получала ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) за 30 мин до введения фенамина. Фиксировался латентный период возникновения беспокойства животных (мин), длительность двигательной активности (мин), а также длительность стереотипии (с). Для детализации полученных данных применялись тесты для верификации серотонинергической, дофаминергической и адренергической активностей ДАБ-21. Для анализа влияния ДАБ-21 на серотонинер-гическую нейротрансмиссию использовался тест «5-гидрокситриптофанового гиперкинеза» на мышах: как известно, введение 5-ГТФ приводит к возникновению у мышей резких встряхиваний головой в результате активации 5-НТ2-рецепторов. В эксперименте использованы: 1) группа контроля (5-ГТФ, «Sigma», США, 300 мг/кг, в/б); 2) опытная группа (ДАБ-21, 2,52 мг/кг, в/ж, за 30 мин до введения 5-ГТФ). Число встряхиваний головой оценивалось каждые 10 минут в экспериментальных группах на протяжении 60 мин после введения 5-ГТФ. Изменение дофаминергической передачи под действием ДАБ-21 оценивалось в тестах «Апоморфи-новая стереотипия» и «Галоперидоловая каталепсия». В тесте «Апоморфиновой стереотипии» (мыши): 1) группа контроля получала апоморфин («ICN Biomedical», США, 1 мг/кг, в/б); 2) опытная группа - ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) за 30 мин до введения апоморфина. Результаты оценивались по балльной шкале каждые 30 мин эксперимента на протяжении 120 мин: 0 баллов - отсутствие стереотипии, 1 балл - отдельные стереотипные движения (в том числе непостоянное принюхивание), 2 балла - наличие непродолжительно длящейся интенсивной стереотипии (в том числе лизания и грызения), 3 балла - постоянная и интенсивная стереотипия [5]. В тесте «Галоперидоловой каталепсии» оценивалась способность крыс к сохранению заданной непривычной позы. Были задействованы: 1) группа контроля (галоперидол, ЗАО «Биннофарм», Россия, 3 мг/кг, в/б); 2) опытная группа (ДАБ-21, 2,52 мг/кг, в/ж, за 30 мин до введения галоперидола). Выраженность каталепсии оценивалась в баллах каждые 30 мин эксперимента на протяжении 120 минут по шкале C, M orpugo (1962) [8]: 1 балл - передняя лапа крысы слегка отводится и помещается на подставку высотой 3 см; 2 балла - крыса стоит на задних лапах, одна передняя помещена на подставку высотой 10 см; 3 балла - крыса стоит на передних лапах, одна задняя лапа помещена на подставку высотой 10 см. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Изучить возможные взаимодействия соединения ДАБ-21 с основными лигандами нейромедиаторных систем методами фармакологического анализа in vivo. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты проводились на 224 белых аут-бредных мышах-самцах массой 18-22 г и 16 белых аутбредных крысах-самцах массой 160-180 г, полученных из ФГУП «ПЛЖ «Рапполово» (Ленинградская обл., Россия), разделенных методом случайного выбора на равные группы (n = 8). Животные содержались в условиях вивария с естественным световым режимом на стандартной пищевой диете лабораторных животных без ограничения доступа к еде и воде (ГОСТ Р 50258-92), с соблюдением «Международных рекомендаций по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях» (2017). Выполнение работы соответствует параметрам по доклиническим исследованиям (Приказ Минздрава России от 01.04.2016 № 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики», зарегистрировано в Минюсте России 15.08.2016 № 43232). Производное диазепино[1,2-а]бензимидазола соединение ДАБ-21 синтезировано НИИ ФОХ ЮФУ г. Ростова-на-Дону [1]. При исследовании возможного взаимодействия ДАБ-21 с базовыми нейромедиаторными системами использовались методики in vivo, позволяющие оценить активность субстанции ДАБ-21 в отношении адренергической, серотонинергической, дофаминергической, холинергической и ГАМК-ергической систем, а также МАО-ингибирующую активность соединения. Эксперименты выполнены в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [6]. Для первичной оценки взаимодействия ДАБ-21 с ГАМК-ергической системой использовался тест «Приподнятый крестообразный лабиринт» на мышах с применением антагониста бензодиазепиновых рецепторов флумазенила (ACS, США, 1 мг/кг). В качестве препарата сравнения использован диазепам (2 мг/кг). Доза ДАБ-21 была рассчитана эквимолярно диазепаму и составила 2,52 мг/кг. Группа контроля получала растворитель (дистиллированную воду) в эквивалентном объеме: 0,1 мл на 10 г веса животного. Опытные группы получали: 1) диазепам (2 мг/кг); 2) диазепам (2 мг/кг) и флумазенил (1 мг/кг, за 30 минут до введения диазепама); 3) ДАБ-21 (2,52 мг/кг); 4) ДАБ-21 (2,52 мг/кг) и флумазенил (1 мг/кг, за 30 мин до введения ДАБ-21). Все вещества вводились мышам атравматичным зондом внутрижелудочно, тестовое наблюдение начиналось через 30 мин после их введения. Регистрировались параметры: время (с) и число 137 Выпуск 1 (77). 2021 ВЕСТНИК Во н ГМУ Регистрация длительности тремора (с) и латентного периода его возникновения (с) проводилась сразу п о сл е введения ареколина. Н-холинотропный потенциал ДАБ-21 оценивался в тесте «Никотинового тремора»: 1) первая группа контроля получала никотин (2 мг/кг), в результате чего у животных развивался тремор, но судорог не наблюдалось; 2) вторая группа контроля получала никотин (4 мг/кг), что приводило к развитию судорог у 100 % мышей; 3) первая опытная группа получала ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) за 30 мин до введения никотина (2 мг/кг); 4) вторая опытная группа получала ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) за 30 мин до введения никотина (4 мг/кг). Результаты теста оценивались процентным отношением животных, у которых развивались судороги или тремор, к общему числу животных в группе. Статистическая обработка полученных данных осуществлялась с применением теста Колмогорова -Смирнова с поправкой Делайла - Вилкоксона -Лилиефорса для малых выборок. Для непараметрического распределения данных применен критерий Крас-келла - Уоллиса и пост-тест Данна. Для парных сравнений использовали U-критерий Манна - Уитни. Вычисления реализованы в программе GraphPad Prism v.5.0. Результаты представлены в виде M ± SEM, p « 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ По результатам теста с флумазенилом в «Приподнятом крестообразном лабиринте» показано, что флум а зенил устраняет анксиолитический эффект диазепама и ДАБ-21: время, проведенное мышами в светлом рукаве установки, снизилось практически в 20 раз для диазепама и в 10 раз для ДАБ-21. Количество выходов в светлый рукав в группах диазепама и ДАБ-21 п од влиянием флумазенила было снижено (табл. 1). Оценка взаимодействия ДАБ-21 с адренергической системой производилась с помощью тестов, основанных на гипотермическом эффекте клофелина и резерпина. В тесте «Клофелиновая гипотермия» на мышах задействованы: 1) группа интактного контроля; 2) контрольная группа, получавшая клофелин (АО «Органика», Россия, 0,1 мг/кг, в/б); 3) опытная группа, получавшая ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) за 30 мин до введения клофелина. Оценивалось изменение ректальной температуры мышей с помощью термодатчика AnD DT-623 (A&D, Китай) при погружении электрода на глубину 1,5-1,8 см каждые 30 мин эксперимента на протяжении 120 минут. Тест «Резер-пиновая гипотермия» на мышах включал: 1) интактный контроль; 2) контроль с резерпином («Польфа», Польша, 2,5 мг/кг, в/б); 3) опытную группу, получавшую ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) за 30 мин до введения резерпина. Оценивалось изменение ректальной температуры мышей до введения резерпина, а также через 240 и 270 мин эксперимента. Наличие МАО-ингибирующей активности ДАБ-21 проверяли тестом «Стереотипии, обусловленной L-ДОФА». Первая группа контроля получала L-ДОФА («Sigma», США, 500 мг/кг, в/ж), вторая группа контроля - L-ДОФА (100 мг/кг, в/ж), опытная группа -L-ДОФА (100 мг/кг, в/ж) и ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж). Выраженность стереотипии подсчитывали в баллах через 30, 60 и 90 мин после начала эксперимента, балльная шкала была аналогична таковой для теста «Апоморфиновая стереотипия». Для определения степени центрального М-холин-ергического потенциала ДАБ-21 применялся тест с ареколином, при применении которого у мышей развивались гиперсаливация и тремор: 1) контрольная группа мышей получала ареколин в дозе 15 мг/кг в/б; 2) опытная группа получала ДАБ-21 в дозе 2,52 мг/кг в/ж за 30 мин до введения ареколина. Таблица 1 Влияние введения флумазенила (1 мг/кг, в/ж) на поведение мышей в установке «Приподнятый крестообразный лабиринт» при введении соединения ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) и диазепама (2 мг/кг, в/ж), M ± SEM Показатель Количество переходов (общее) В ре мя н ахожде ния в открытом рукаве (с) Количество выходов в открытый рукав Количество свешиваний Кол и чество болюсов Контроль 2,2 ± 0,4 13,50 ± 6,17 0,70 ± 0,33 5,00 ± 0,52 2,50 ± 72 Диазепам 9,30 ± 0,42* 100,80 ± 5,68* 4,00 ± 0,45* 16,70 ± 0,88 0,20 ± 0,17* Флумазенил + Диазепам 3,3 ± 0,8 5,5 ± 5,5 0,30 ± 0,33 3,20 ± 0,87 0,70 ± 0,33 ДАБ-21 11,50 ± 0,76* 112,00 ± 6,65* 4,80 ± 0,17* 19,50 ± 1,38* 0,20 ± 0,17* Флумазенил + ДАБ-21 3,80 ± 0,75 13,2 ± 9,6 0,70 ± 0,42 3,80 ± 0,87 0,80 ± 0,31 “Данные достоверны по отношению к контролю (р « 0,05, критерий Краскелла - Уоллиса и пост-тест Данна). Выраженность «Стереотипии, обусловленной L-ДОФА» (500 мг/кг, в/ж) на 30-й мин наблюдения составила (2,30 ± 0,33) балла, на 90-й - снизилась вдвое. Под действием L-ДОФА (100 мг/кг, в/ж) двигательной стереотипии мышей не наблюдалось на протяжении всего эксперимента. Под действием ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) эффект L-ДОФА (100 мг/кг, в/ж) на 30-й мин наблюдения составил (1,30 ± 0,33) балла, а на 90-й - около трети от указанного уровня, что говорит о незначительном потенциировании действия L-ДОФА в малых дозах (р « 0,05) (табл. 3). Таблица 3 Влияние введения соединения ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) на эффекты L-ДОФА (100 и 500 мг/кг, в/ж), мыши, M ± SEM Мин Выраженность стереотипии, баллы контроль 1 (L-ДОФА 500 мг/кг) контроль 2 (L-ДОФА 100 мг/кг) ДАБ-21 + L-ДОФА 100 мг/кг 30 2,30 ± 0,33 0,00 ± 0,01* 1,30 ± 0,33 60 1,70 ± 0,33 0,00 ± 0,01* 0,50 ± 0,22 90 1,20 ± 0,17 0,00 ± 0,01* 0,50 ± 0,34 “Данные достоверны по отношению к контролю 1 (р « 0,05, критерий Краскелла - Уоллиса и посттест Данна). В тесте «5-гидрокситриптофаного гиперкинеза» в группе контроля число встряхиваний головой составило (9,80 ± 1,92) на 10-й мин и (0,20 ± 0,17) на 60-й мин. В группе, получавшей ДАБ-21, наблюдали потенциирование эффектов 5-ГТФ: на 10-й мин показатель составил (14,30 ± 4,12), а на 60-й -(5,80 ± 3,69) (р « 0,05). В тесте «Апоморфиновой стереотипии» выраженность стереотипии в группе контроля (апоморфин, 1 мг/кг, в/б) составила (1,60 ± 0,25) балла на 30-й мин и (0,60 ± 0,25) балла на 120-й мин эксперимента. В группе мышей, получавших ДАБ-21, показатель составил (1,00 ± 0,32) баллов в начале теста и (0,40 ± 0,25) - на 120-й мин, что говорит об отсутствии статистически значимого отличия между группами (р « 0,05). В эксперименте «Галоперидоловой каталепсии» выраженность каталепсии в группе галоперидола (3 мг/кг, в/б) на 15-й мин наблюдения составила (2,20 ± 0,54) балла, на 120-й мин - (2,70 ± 0,33) балла. Под действием ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) показатель достоверно снижался до (1,30 ± 0,49) баллов на 15-й мин и (1,50 ± 0,22) - на 120-й (р « 0,05). Ареколиновый тремор у мышей в группе контроля (ареколин, 15 мг/кг, в/б) наблюдался на протяжении (489,50 ± 24,71) с, в группе ДАБ-21 - (427,30 ± 65,11) с. Латентный период возникновения тремора При изучении стимулирующих эффектов фенамина длительность двигательной активности мышей, получавших фенамин (5 мг/кг, в/б), составила (1,60 ± 0,13) мин, а в группе ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) - (3,50 ± 0,58) мин. Латентный период возникновения беспокойства был снижен с (5,40 ± 0,86) мин в группе контроля до (5,10 ± 0,40) мин в группе ДАБ-21. Длительность стереотипии в группе контроля (фенамина) составила (218,40 ± 24,05) с, в то время как в группе ДАБ-21 - (596,70 ± 3,80) с. По всем показателям теста «Фенаминовой стереотипии» для группы соединения ДАБ-21 показано статистически значимое увеличение уровня эффектов фенамина (р « 0,05). В эксперименте «Клофелиновая гипотермия» ректальная температура мышей интактного контроля в начале теста составила (38,0 ± 0,04) °С, через 120 мин -(37,70 ± 0,16) °С. В группе мышей, получавших клофе-лин, ректальная температура упала с (38,10 ± 0,07) °С в начале эксперимента до (37,20 ± 0,10) °С через 120 мин, что статистически значимо отличается от показателей группы интактного контроля (р « 0,05). В группе ДАБ-21 показатель составил (37,90 ± 0,03) °С в начале теста и (37,50 ± 0,15) °С на 120-й мин. Не показано статистически достоверного различия ректальной температуры мышей, получавших ДАБ-21, с контрольной группой (р « 0,05). В тесте «Резерпиновая гипотермия» в группе интактного контроля ректальная температура мышей в начале эксперимента составила (38,10 ± 0,04) °С и оставалась на том же уровне на протяжении 270 мин наблюдения. Гипотермический эффект резерпина проявлялся в снижении температуры тела мышей на 0,7 °С через 4,5 часа теста, что статистически достоверно отличается от интактного контроля (р « 0,05). В группе ДАБ-21 на 270-й мин теста температура соответствовала уровню интактного контроля (табл. 2). Таблица 2 Влияние применения соединения ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) на гипотермические эффекты резерпина (2,5 мг/кг, в/б), мыши, M ± SEM Ректальная температура, °С Время измерения интактный контроль контроль (резерпин, 2,5 мг/кг) ДАБ-21 (2,52 мг/кг) + резерпин (2,5 мг/кг) 0 (исход) 38,10 ± 0,04 38,10 ± 0,04 38,00 ± 0,01 4 ч 38,10 ± 0,05 37,30 ± 0,90* 37,60 ± 0,85* 4,5 ч 38,10 ± 0,03 37,40 ± 0,12* 37,80 ± 0,10 “Данные статистически значимы по отношению к контролю (p « 0,05, критерий Краскелла - Уоллиса с посттестом Данна). ВЕСТНИК Во н ГМУ Дополнительные тесты на холинергическую активность изучаемого соединения показали наличие слабого М-холинолитического эффекта ДАБ-21 без влияния на никотиновые рецепторы по результатам теста с ареколином и модели «Никотинового тремора». ЗАКЛЮЧЕНИЕ Согласно полученным данным проведенного комплекса тестов, показан антагонистический тип взаимодействия соединения ДАБ-21 в дозе 2,52 мг/кг с флума-зенилом, галоперидолом, клофелином и резерпином, а также потенциирование эффектов фенамина и серотонина. Влияния экспериментального соединения на эффекты никотина отмечено не было. с (72,50 ± 4,67) с в группе контроля был статистически значимо увеличен до (94,50 ± 6,65) с в группе соединения ДАБ-21 (р ^ 0,05), В эксперименте «Никотинового тремора» процент животных, у которых возник тремор, в первой контрольной группе, получавшей никотин (2 мг/кг, в/б), составил 100 %. Аналогичный уровень эффекта наблюдался для второй контрольной группы, получавшей никотин в дозе 4 мг/кг. У животных первой контрольной группы не развивались судороги; во второй контрольной группе судороги развивались в 100 % случаев. При тестировании ДАБ-21 на Н-холинергическую активность зарегистрированные значения полностью соответствовали контрольным (р ^ 0,05). По результатам теста «Приподнятый крестообразный лабиринт» для соединения ДАБ-21 отмечен антагонизм с флумазенилом, что характерно для диа-зепиновой структуры соединения и позволяет предположить ГАМК-ассоциированное действие изучаемого вещества, вероятно, опосредованное бензодиазепино-вым сайтом связывания рецепторной макромолекулы. Выявление неспецифического катехоламинстимули-рующего эффекта ДАБ-21, подкрепленного потен-циированием действия фенамина, позволило инициировать ряд дополнительных исследований по детализации отмеченного действия. В рамках теста «5-гидрокситриптофановый гиперкинез» потенциирование под влиянием ДАБ-21 эффектов 5-ГТФ позволяет отметить серотонин-активирующий эффект ДАБ-21. Для клофелина характерен постсинаптический а2-адреномиметический эффект. В тесте «Клофелиновой гипотермии» введение соединения ДАБ-21 приводило к слабому а2-адрено-блокирующему эффекту. Некоторый антагонизм с блокатором дофаминовых рецепторов II типа галоперидо-лом в тесте «Галоперидоловой каталепсии» позволяет предположить D2-активирующее действие ДАБ-21, что, согласно литературным данным [7], является одним из путей реализации антидепрессивного эффекта новых препаратов. В тесте с резерпином было отмечено снижение эффектов индуктора на фоне действия ДАБ-21. Ввиду симпатолитической активности резерпина была выдвинута гипотеза о наличии у ДАБ-21 некоторого МАО-ингибирующего эффекта, что было проверено в дополнительном тесте с L-ДОФА. Поскольку известно, что двигательная стереотипия наблюдается у животных при введении высоких доз L-ДОФА, а при применении ингибиторов МАО указанный эффект наблюдается и в низких дозах, можно предположить наличие у ДАБ-21 МАО-ингибирующего эффекта.

About the authors

D. V. Maltsev

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation; SBI «Volgograd Medical Research Center»

Email: maltsevdmitriy@rambler.ru
Department of pharmacology and bioinformatics; laboratory of experimental pharmacology

A. A Spasov

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation; SBI «Volgograd Medical Research Center»

Department of pharmacology and bioinformatics; laboratory of experimental pharmacology

M. V. Miroshnikov

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Department of pharmacology and bioinformatics

M. O. Skripka

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Department of pharmacology and bioinformatics

Yu. Yu Dementenko

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Department of pharmacology and bioinformatics

E. M Chernikova

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation

Department of pharmacology and bioinformatics

References

Supplementary files