АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРОИЗВОДНОГО ДИАЗЕПИНО[1,2-а]БЕНЗИМИДАЗОЛА СОЕДИНЕНИЯ ДАБ-21 С ОСНОВНЫМИ ЛИГАНДАМИ НЕЙРОМЕДИАТОРНЫХ СИСТЕМ

Полный текст

Ввиду большого разнообразия спектров фармакологической активности привилегированных подструктур, входящих в состав изучаемой субстанции, становится очевидна необходимость проведения фармакологического анализа соединения на возможность проявления различных нейромедиаторных взаимодействий. В ранее проведенных исследованиях была показана перспективная анксиолитическая и антидепрессивная активности производного диазепино[1,2-а] бензимидазола под шифром ДАБ-21 [2, 4]. Для производных диазепина характерны выраженные нейропсихотропные свойства, в то время как для бензимидазолов отмечены противомигренозные, психостимулирующие, противосудорожные и многие другие фармакологические эффекты [3]. выходов мышей в открытый рукав, общее число переходов, число свешиваний и болюсов. Для выявления неспецифического катехоламинер-гического действия ДАБ-21 применен тест «Фенами-новая стереотипия»: 1) контрольная группа мышей получала фенамин (5 мг/кг, в/б); 2) опытная группа получала ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) за 30 мин до введения фенамина. Фиксировался латентный период возникновения беспокойства животных (мин), длительность двигательной активности (мин), а также длительность стереотипии (с). Для детализации полученных данных применялись тесты для верификации серотонинергической, дофаминергической и адренергической активностей ДАБ-21. Для анализа влияния ДАБ-21 на серотонинер-гическую нейротрансмиссию использовался тест «5-гидрокситриптофанового гиперкинеза» на мышах: как известно, введение 5-ГТФ приводит к возникновению у мышей резких встряхиваний головой в результате активации 5-НТ2-рецепторов. В эксперименте использованы: 1) группа контроля (5-ГТФ, «Sigma», США, 300 мг/кг, в/б); 2) опытная группа (ДАБ-21, 2,52 мг/кг, в/ж, за 30 мин до введения 5-ГТФ). Число встряхиваний головой оценивалось каждые 10 минут в экспериментальных группах на протяжении 60 мин после введения 5-ГТФ. Изменение дофаминергической передачи под действием ДАБ-21 оценивалось в тестах «Апоморфи-новая стереотипия» и «Галоперидоловая каталепсия». В тесте «Апоморфиновой стереотипии» (мыши): 1) группа контроля получала апоморфин («ICN Biomedical», США, 1 мг/кг, в/б); 2) опытная группа - ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) за 30 мин до введения апоморфина. Результаты оценивались по балльной шкале каждые 30 мин эксперимента на протяжении 120 мин: 0 баллов - отсутствие стереотипии, 1 балл - отдельные стереотипные движения (в том числе непостоянное принюхивание), 2 балла - наличие непродолжительно длящейся интенсивной стереотипии (в том числе лизания и грызения), 3 балла - постоянная и интенсивная стереотипия [5]. В тесте «Галоперидоловой каталепсии» оценивалась способность крыс к сохранению заданной непривычной позы. Были задействованы: 1) группа контроля (галоперидол, ЗАО «Биннофарм», Россия, 3 мг/кг, в/б); 2) опытная группа (ДАБ-21, 2,52 мг/кг, в/ж, за 30 мин до введения галоперидола). Выраженность каталепсии оценивалась в баллах каждые 30 мин эксперимента на протяжении 120 минут по шкале C, M orpugo (1962) [8]: 1 балл - передняя лапа крысы слегка отводится и помещается на подставку высотой 3 см; 2 балла - крыса стоит на задних лапах, одна передняя помещена на подставку высотой 10 см; 3 балла - крыса стоит на передних лапах, одна задняя лапа помещена на подставку высотой 10 см. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Изучить возможные взаимодействия соединения ДАБ-21 с основными лигандами нейромедиаторных систем методами фармакологического анализа in vivo. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты проводились на 224 белых аут-бредных мышах-самцах массой 18-22 г и 16 белых аутбредных крысах-самцах массой 160-180 г, полученных из ФГУП «ПЛЖ «Рапполово» (Ленинградская обл., Россия), разделенных методом случайного выбора на равные группы (n = 8). Животные содержались в условиях вивария с естественным световым режимом на стандартной пищевой диете лабораторных животных без ограничения доступа к еде и воде (ГОСТ Р 50258-92), с соблюдением «Международных рекомендаций по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях» (2017). Выполнение работы соответствует параметрам по доклиническим исследованиям (Приказ Минздрава России от 01.04.2016 № 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики», зарегистрировано в Минюсте России 15.08.2016 № 43232). Производное диазепино[1,2-а]бензимидазола соединение ДАБ-21 синтезировано НИИ ФОХ ЮФУ г. Ростова-на-Дону [1]. При исследовании возможного взаимодействия ДАБ-21 с базовыми нейромедиаторными системами использовались методики in vivo, позволяющие оценить активность субстанции ДАБ-21 в отношении адренергической, серотонинергической, дофаминергической, холинергической и ГАМК-ергической систем, а также МАО-ингибирующую активность соединения. Эксперименты выполнены в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [6]. Для первичной оценки взаимодействия ДАБ-21 с ГАМК-ергической системой использовался тест «Приподнятый крестообразный лабиринт» на мышах с применением антагониста бензодиазепиновых рецепторов флумазенила (ACS, США, 1 мг/кг). В качестве препарата сравнения использован диазепам (2 мг/кг). Доза ДАБ-21 была рассчитана эквимолярно диазепаму и составила 2,52 мг/кг. Группа контроля получала растворитель (дистиллированную воду) в эквивалентном объеме: 0,1 мл на 10 г веса животного. Опытные группы получали: 1) диазепам (2 мг/кг); 2) диазепам (2 мг/кг) и флумазенил (1 мг/кг, за 30 минут до введения диазепама); 3) ДАБ-21 (2,52 мг/кг); 4) ДАБ-21 (2,52 мг/кг) и флумазенил (1 мг/кг, за 30 мин до введения ДАБ-21). Все вещества вводились мышам атравматичным зондом внутрижелудочно, тестовое наблюдение начиналось через 30 мин после их введения. Регистрировались параметры: время (с) и число 137 Выпуск 1 (77). 2021 ВЕСТНИК Во н ГМУ Регистрация длительности тремора (с) и латентного периода его возникновения (с) проводилась сразу п о сл е введения ареколина. Н-холинотропный потенциал ДАБ-21 оценивался в тесте «Никотинового тремора»: 1) первая группа контроля получала никотин (2 мг/кг), в результате чего у животных развивался тремор, но судорог не наблюдалось; 2) вторая группа контроля получала никотин (4 мг/кг), что приводило к развитию судорог у 100 % мышей; 3) первая опытная группа получала ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) за 30 мин до введения никотина (2 мг/кг); 4) вторая опытная группа получала ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) за 30 мин до введения никотина (4 мг/кг). Результаты теста оценивались процентным отношением животных, у которых развивались судороги или тремор, к общему числу животных в группе. Статистическая обработка полученных данных осуществлялась с применением теста Колмогорова -Смирнова с поправкой Делайла - Вилкоксона -Лилиефорса для малых выборок. Для непараметрического распределения данных применен критерий Крас-келла - Уоллиса и пост-тест Данна. Для парных сравнений использовали U-критерий Манна - Уитни. Вычисления реализованы в программе GraphPad Prism v.5.0. Результаты представлены в виде M ± SEM, p « 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ По результатам теста с флумазенилом в «Приподнятом крестообразном лабиринте» показано, что флум а зенил устраняет анксиолитический эффект диазепама и ДАБ-21: время, проведенное мышами в светлом рукаве установки, снизилось практически в 20 раз для диазепама и в 10 раз для ДАБ-21. Количество выходов в светлый рукав в группах диазепама и ДАБ-21 п од влиянием флумазенила было снижено (табл. 1). Оценка взаимодействия ДАБ-21 с адренергической системой производилась с помощью тестов, основанных на гипотермическом эффекте клофелина и резерпина. В тесте «Клофелиновая гипотермия» на мышах задействованы: 1) группа интактного контроля; 2) контрольная группа, получавшая клофелин (АО «Органика», Россия, 0,1 мг/кг, в/б); 3) опытная группа, получавшая ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) за 30 мин до введения клофелина. Оценивалось изменение ректальной температуры мышей с помощью термодатчика AnD DT-623 (A&D, Китай) при погружении электрода на глубину 1,5-1,8 см каждые 30 мин эксперимента на протяжении 120 минут. Тест «Резер-пиновая гипотермия» на мышах включал: 1) интактный контроль; 2) контроль с резерпином («Польфа», Польша, 2,5 мг/кг, в/б); 3) опытную группу, получавшую ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) за 30 мин до введения резерпина. Оценивалось изменение ректальной температуры мышей до введения резерпина, а также через 240 и 270 мин эксперимента. Наличие МАО-ингибирующей активности ДАБ-21 проверяли тестом «Стереотипии, обусловленной L-ДОФА». Первая группа контроля получала L-ДОФА («Sigma», США, 500 мг/кг, в/ж), вторая группа контроля - L-ДОФА (100 мг/кг, в/ж), опытная группа -L-ДОФА (100 мг/кг, в/ж) и ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж). Выраженность стереотипии подсчитывали в баллах через 30, 60 и 90 мин после начала эксперимента, балльная шкала была аналогична таковой для теста «Апоморфиновая стереотипия». Для определения степени центрального М-холин-ергического потенциала ДАБ-21 применялся тест с ареколином, при применении которого у мышей развивались гиперсаливация и тремор: 1) контрольная группа мышей получала ареколин в дозе 15 мг/кг в/б; 2) опытная группа получала ДАБ-21 в дозе 2,52 мг/кг в/ж за 30 мин до введения ареколина. Таблица 1 Влияние введения флумазенила (1 мг/кг, в/ж) на поведение мышей в установке «Приподнятый крестообразный лабиринт» при введении соединения ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) и диазепама (2 мг/кг, в/ж), M ± SEM Показатель Количество переходов (общее) В ре мя н ахожде ния в открытом рукаве (с) Количество выходов в открытый рукав Количество свешиваний Кол и чество болюсов Контроль 2,2 ± 0,4 13,50 ± 6,17 0,70 ± 0,33 5,00 ± 0,52 2,50 ± 72 Диазепам 9,30 ± 0,42* 100,80 ± 5,68* 4,00 ± 0,45* 16,70 ± 0,88 0,20 ± 0,17* Флумазенил + Диазепам 3,3 ± 0,8 5,5 ± 5,5 0,30 ± 0,33 3,20 ± 0,87 0,70 ± 0,33 ДАБ-21 11,50 ± 0,76* 112,00 ± 6,65* 4,80 ± 0,17* 19,50 ± 1,38* 0,20 ± 0,17* Флумазенил + ДАБ-21 3,80 ± 0,75 13,2 ± 9,6 0,70 ± 0,42 3,80 ± 0,87 0,80 ± 0,31 “Данные достоверны по отношению к контролю (р « 0,05, критерий Краскелла - Уоллиса и пост-тест Данна). Выраженность «Стереотипии, обусловленной L-ДОФА» (500 мг/кг, в/ж) на 30-й мин наблюдения составила (2,30 ± 0,33) балла, на 90-й - снизилась вдвое. Под действием L-ДОФА (100 мг/кг, в/ж) двигательной стереотипии мышей не наблюдалось на протяжении всего эксперимента. Под действием ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) эффект L-ДОФА (100 мг/кг, в/ж) на 30-й мин наблюдения составил (1,30 ± 0,33) балла, а на 90-й - около трети от указанного уровня, что говорит о незначительном потенциировании действия L-ДОФА в малых дозах (р « 0,05) (табл. 3). Таблица 3 Влияние введения соединения ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) на эффекты L-ДОФА (100 и 500 мг/кг, в/ж), мыши, M ± SEM Мин Выраженность стереотипии, баллы контроль 1 (L-ДОФА 500 мг/кг) контроль 2 (L-ДОФА 100 мг/кг) ДАБ-21 + L-ДОФА 100 мг/кг 30 2,30 ± 0,33 0,00 ± 0,01* 1,30 ± 0,33 60 1,70 ± 0,33 0,00 ± 0,01* 0,50 ± 0,22 90 1,20 ± 0,17 0,00 ± 0,01* 0,50 ± 0,34 “Данные достоверны по отношению к контролю 1 (р « 0,05, критерий Краскелла - Уоллиса и посттест Данна). В тесте «5-гидрокситриптофаного гиперкинеза» в группе контроля число встряхиваний головой составило (9,80 ± 1,92) на 10-й мин и (0,20 ± 0,17) на 60-й мин. В группе, получавшей ДАБ-21, наблюдали потенциирование эффектов 5-ГТФ: на 10-й мин показатель составил (14,30 ± 4,12), а на 60-й -(5,80 ± 3,69) (р « 0,05). В тесте «Апоморфиновой стереотипии» выраженность стереотипии в группе контроля (апоморфин, 1 мг/кг, в/б) составила (1,60 ± 0,25) балла на 30-й мин и (0,60 ± 0,25) балла на 120-й мин эксперимента. В группе мышей, получавших ДАБ-21, показатель составил (1,00 ± 0,32) баллов в начале теста и (0,40 ± 0,25) - на 120-й мин, что говорит об отсутствии статистически значимого отличия между группами (р « 0,05). В эксперименте «Галоперидоловой каталепсии» выраженность каталепсии в группе галоперидола (3 мг/кг, в/б) на 15-й мин наблюдения составила (2,20 ± 0,54) балла, на 120-й мин - (2,70 ± 0,33) балла. Под действием ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) показатель достоверно снижался до (1,30 ± 0,49) баллов на 15-й мин и (1,50 ± 0,22) - на 120-й (р « 0,05). Ареколиновый тремор у мышей в группе контроля (ареколин, 15 мг/кг, в/б) наблюдался на протяжении (489,50 ± 24,71) с, в группе ДАБ-21 - (427,30 ± 65,11) с. Латентный период возникновения тремора При изучении стимулирующих эффектов фенамина длительность двигательной активности мышей, получавших фенамин (5 мг/кг, в/б), составила (1,60 ± 0,13) мин, а в группе ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) - (3,50 ± 0,58) мин. Латентный период возникновения беспокойства был снижен с (5,40 ± 0,86) мин в группе контроля до (5,10 ± 0,40) мин в группе ДАБ-21. Длительность стереотипии в группе контроля (фенамина) составила (218,40 ± 24,05) с, в то время как в группе ДАБ-21 - (596,70 ± 3,80) с. По всем показателям теста «Фенаминовой стереотипии» для группы соединения ДАБ-21 показано статистически значимое увеличение уровня эффектов фенамина (р « 0,05). В эксперименте «Клофелиновая гипотермия» ректальная температура мышей интактного контроля в начале теста составила (38,0 ± 0,04) °С, через 120 мин -(37,70 ± 0,16) °С. В группе мышей, получавших клофе-лин, ректальная температура упала с (38,10 ± 0,07) °С в начале эксперимента до (37,20 ± 0,10) °С через 120 мин, что статистически значимо отличается от показателей группы интактного контроля (р « 0,05). В группе ДАБ-21 показатель составил (37,90 ± 0,03) °С в начале теста и (37,50 ± 0,15) °С на 120-й мин. Не показано статистически достоверного различия ректальной температуры мышей, получавших ДАБ-21, с контрольной группой (р « 0,05). В тесте «Резерпиновая гипотермия» в группе интактного контроля ректальная температура мышей в начале эксперимента составила (38,10 ± 0,04) °С и оставалась на том же уровне на протяжении 270 мин наблюдения. Гипотермический эффект резерпина проявлялся в снижении температуры тела мышей на 0,7 °С через 4,5 часа теста, что статистически достоверно отличается от интактного контроля (р « 0,05). В группе ДАБ-21 на 270-й мин теста температура соответствовала уровню интактного контроля (табл. 2). Таблица 2 Влияние применения соединения ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) на гипотермические эффекты резерпина (2,5 мг/кг, в/б), мыши, M ± SEM Ректальная температура, °С Время измерения интактный контроль контроль (резерпин, 2,5 мг/кг) ДАБ-21 (2,52 мг/кг) + резерпин (2,5 мг/кг) 0 (исход) 38,10 ± 0,04 38,10 ± 0,04 38,00 ± 0,01 4 ч 38,10 ± 0,05 37,30 ± 0,90* 37,60 ± 0,85* 4,5 ч 38,10 ± 0,03 37,40 ± 0,12* 37,80 ± 0,10 “Данные статистически значимы по отношению к контролю (p « 0,05, критерий Краскелла - Уоллиса с посттестом Данна). ВЕСТНИК Во н ГМУ Дополнительные тесты на холинергическую активность изучаемого соединения показали наличие слабого М-холинолитического эффекта ДАБ-21 без влияния на никотиновые рецепторы по результатам теста с ареколином и модели «Никотинового тремора». ЗАКЛЮЧЕНИЕ Согласно полученным данным проведенного комплекса тестов, показан антагонистический тип взаимодействия соединения ДАБ-21 в дозе 2,52 мг/кг с флума-зенилом, галоперидолом, клофелином и резерпином, а также потенциирование эффектов фенамина и серотонина. Влияния экспериментального соединения на эффекты никотина отмечено не было. с (72,50 ± 4,67) с в группе контроля был статистически значимо увеличен до (94,50 ± 6,65) с в группе соединения ДАБ-21 (р ^ 0,05), В эксперименте «Никотинового тремора» процент животных, у которых возник тремор, в первой контрольной группе, получавшей никотин (2 мг/кг, в/б), составил 100 %. Аналогичный уровень эффекта наблюдался для второй контрольной группы, получавшей никотин в дозе 4 мг/кг. У животных первой контрольной группы не развивались судороги; во второй контрольной группе судороги развивались в 100 % случаев. При тестировании ДАБ-21 на Н-холинергическую активность зарегистрированные значения полностью соответствовали контрольным (р ^ 0,05). По результатам теста «Приподнятый крестообразный лабиринт» для соединения ДАБ-21 отмечен антагонизм с флумазенилом, что характерно для диа-зепиновой структуры соединения и позволяет предположить ГАМК-ассоциированное действие изучаемого вещества, вероятно, опосредованное бензодиазепино-вым сайтом связывания рецепторной макромолекулы. Выявление неспецифического катехоламинстимули-рующего эффекта ДАБ-21, подкрепленного потен-циированием действия фенамина, позволило инициировать ряд дополнительных исследований по детализации отмеченного действия. В рамках теста «5-гидрокситриптофановый гиперкинез» потенциирование под влиянием ДАБ-21 эффектов 5-ГТФ позволяет отметить серотонин-активирующий эффект ДАБ-21. Для клофелина характерен постсинаптический а2-адреномиметический эффект. В тесте «Клофелиновой гипотермии» введение соединения ДАБ-21 приводило к слабому а2-адрено-блокирующему эффекту. Некоторый антагонизм с блокатором дофаминовых рецепторов II типа галоперидо-лом в тесте «Галоперидоловой каталепсии» позволяет предположить D2-активирующее действие ДАБ-21, что, согласно литературным данным [7], является одним из путей реализации антидепрессивного эффекта новых препаратов. В тесте с резерпином было отмечено снижение эффектов индуктора на фоне действия ДАБ-21. Ввиду симпатолитической активности резерпина была выдвинута гипотеза о наличии у ДАБ-21 некоторого МАО-ингибирующего эффекта, что было проверено в дополнительном тесте с L-ДОФА. Поскольку известно, что двигательная стереотипия наблюдается у животных при введении высоких доз L-ДОФА, а при применении ингибиторов МАО указанный эффект наблюдается и в низких дозах, можно предположить наличие у ДАБ-21 МАО-ингибирующего эффекта.

Об авторах

Дмитрий Васильевич Мальцев

ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации; ГБУ «Волгоградский медицинский научный центр»

Email: maltsevdmitriy@rambler.ru
кафедра фармакологии и биоинформатики; к. б. н., доцент

А. А Спасов

ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации; ГБУ «Волгоградский медицинский научный центр»

кафедра фармакологии и биоинформатики

М. В Мирошников

ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

кафедра фармакологии и биоинформатики

М. О Скрипка

ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

кафедра фармакологии и биоинформатики

Ю. Ю Дементенко

ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

кафедра фармакологии и биоинформатики

Е. М Черникова

ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

кафедра фармакологии и биоинформатики

Список литературы

Дополнительные файлы