INFLUENCE OF GROWTH FACTORS ON SPERMATOGENESIS AFTER AIMED IRRADIATION OF RAT TESTES WITH ELECTRONS IN A DOSE OF 8 GRAY

Full Text

Около половины всех случаев бесплодия в семейных парах обусловлено «мужским фактором», а у 2 % мужчин наблюдается снижение функций, качественных и количественных параметров сперматогенеза (олиго-спермия и азооспермия) в результате действия на яички одного или нескольких факторов (идиопатический, инфекционный, аутоимунный и другие) [1-3]. Изучение механизмов нарушения сперматогенеза требует создания моделей, для чего могут быть использованы химиотерапевтические цитостатические препараты, а также облучение [4]. Яичко - радиочувствительный орган, в котором дозы общего облучения от 0,1 Гр и выше вызывают обратимые или необратимые повреждения, что связано с сенсибилизацией активно пролиферирующих половых клеток. Количество сперматозоидов и наличие морфологических аномалий были описаны при облучении в дозах от 1 до 2 Гр [5, 6]. Для восстановления сперматогенеза было предложено применение плазмы, обогащенной тромбоцитами (Leukocite-Poor Platelet-Rich Plasma, LP-PRP), ввиду наличия в ней биологически активных веществ, потенциально способных повышать количественные и качественные характеристики гамет [7]. Была описана способность инсулиноподобного фактора роста увеличивать количество округлых и удлиненных сперматид в культивируемых MTF (mouse testicular fragment) новорожденных, что делает его одним из ключевых факторов роста в LP-PRP. Исходя из потенциально положительного эффекта плазмы, обогащенной тромбоцитами, а также его усиления путем дополнительного введения IGF, становится возможным их комбинаторное применение в качестве регенеративного субстрата для восстановления фертильности. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Морфологическая оценка сперматогенеза при использовании плазмы, обогащенной тромбоцитами, после облучения электронами в дозе 8 Грей. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Экспериментальное морфологическое исследование проводили на базах Сеченовского университета и Экспериментального сектора Медицинского радиологического научного центра имени А.Ф. Цыба. Животные для исследования in vivo - самцы крыс Wistar, (220 ± 20) г, 9-10 недель, n = 60, содержали в виварии при контролируемой температуре (22 °C) и световом периоде (12L:12D) со свободным доступом к воде и крысиному корму. Дизайн эксперимента. Экспериментальные животные были случайным образом поделены на 3 группы (условные названия): I - Контроль, II - 8РТ, III - 8РТ + LP-PRP + IGF. I группе (n = 10) вводили 0,9%-й физиологический раствор NaCl интраперитонеально на протяжении всего эксперимента; II группа (n = 30) - однократное прицельное облучение электронами (доза -8 Гр) тазово-брюшного сегмента с использованием линейного акселератора («NOVAC-11», мощность дозы 1 Гр/мин) в первый день эксперимента; III группа (n = 20) после однократного облучения животные получали LP-PRP (200 мкл, интраперитонеальная инъекция один раз в неделю в течение 4 недель) и IGF (14 МЕ/кг, 0,333 мг/кг, подкожная инъекция один раз в неделю в течение 4 недель). Животных всех групп (I-III) выводили из эксперимента путем введения высоких доз анестетика. Сроки умерщвления: I группа - на 42-е сут.; II группа -по 5 крыс на 7, 14, 21, 28, 35, 42-е сут.; III группа -по 5 крыс на 14, 21, 28 и 35-е сут. Плазму, обогащенную тромбоцитами (LP-PRP), изготавливали согласно стандартной методике [8]. Морфологический блок. После извлечения оценивали внешний вид семенников, состояние паренхимы на разрезе, взвешивали (в граммах) и измеряли, фиксировали в растворе Буэна, приготавливали парафиновые блоки, а затем срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином согласно стандартной методике. Морфологический и морфометрический анализ проводили в 10 случайно выбранных полях зрения микроскопа при увеличении *200 и *400 в 4 рандом-ных срезах с каждого образца, перемещая предметные стекла с равными интервалами вдоль осей X и Y, с использованием полуавтоматического анализатора изображения. Световую микроскопию осуществляли с помощью системы видео-микроскопии (микроскоп Leica DM2000, Германия; камера Leica ICC50 HD; компьютер Platrun LG), а морфометрические данные получали с использованием ПО Olympus DP2-BSW (с версий 2.1 по 2.2, сборка 6212, Токио, Япония). В каждом из полей рассчитывали следующие параметры: объем паренхимы семенника; диаметр извитых семенных канальцев; количество мужских гамет, клеток Сертоли и Лейдига; высоту спермато-генного эпителия. Тестикулярную оценку проводили с использованием критериев S. Johnsen. Статистический анализ. Полученные в результате подсчета данные обрабатывали с использованием компьютерной программы SPSS 12.00 for Windows statistical software package (IBM Analytics, США). Сравнение между группами проводилось с использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA со значимостью p < 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Макро- и микроскопическая оценка. В образцах второй группы отмечали деструктивные изменения семенников: уменьшение количества извитых семенных канальцев в 1,5 раза по сравнению с нормой (600 и 1200 соответственно) и половых клеток; снижение высоты сперматогенного эпителия (ниже 35 мкм) и признаки аплазии. В 1/3 семенных канальцах появились семенные шары (площадь - 0,7 мкм2; диаметр - 0,9 мкм; p < 0,05) - округлые структуры с множественными пикнотичными ядрами и окси-фильной цитоплазмой. Диаметр единичных составил 0,9 мкм, при p < 0,05, что в 1,1 раз больше чем в норме. Оценка по Johnsen - (5,00 ± 0,1) баллов при p < 0,05. Количество клеток Сертоли и Лейдига было снижено незначительно. После введения LP-PRP + IGF отмечали восстановление гистоархитектоники, а также увеличение объема и размеров семенников, количества семенных канальцев (до 900) и гамет, восстановление высоты сперматогенного эпителия (табл. 1, 2, 3, рис.). Таблица 1 Группы Вес семенников, г Объем семенников Контроль 1,5 ± 0,1 1397,5 ± 140,3 8РТ 0,50 ± 0,05* 463,0 ± 43,1* 8РТ + LP-PRP + IGF 0,94 ± 0,07** 1019,0 ± 111,8** * p < 0,05 (контроль и 8РТ); ** p < 0,05 (контроль и 8РТ + LP-PRP + IGF) Вес и объем семенников в экспериментальных группах, p < 0,05 Таблица 2 Группа Площадь семенника, мкм2 Диаметр семенного канальца, мкм Высота сперматогенного эпителия, мкм Контроль 224151,32 ± 44,30 344,4 ± 34,4 110,90 ± 13,05 8РТ 43783,46 ± 7,10* 228,19 ± 35,40* 39,4 ± 15,9* 8РТ + LP-PRP + IGF 168839,52 ± 31,63** 286,73 ± 34,70** 83,60 ± 14,37** * p < 0,05 (контроль и 8РТ); ** p < 0,05 (контроль и 8РТ + LP-PRP + IGF) Таблица 3 Группы Сперматогонии (А и В) *106 Сперматоциты *106 Сперматиды *106 Клетки Сертоли *106 Клетки Лейдига *106 Контроль 117,00 ± 0,31 110,00 ± 0,11 163,00 ± 0,13 12,0 ± 0,2 8,00 ± 0,06 8РТ 25,00 ± 0,13* 68,0 ± 0,2* семенные шары -18,0 ± 0,2 9,0 ± 0,1* 5,00 ± 0,07* 8РТ + LP-PRP + IGF 91,00 ± 0,24** 94,00 ± 0,17** 104,00 ± 0,17** 8,00 ± 0,15** 4,00 ± 0,07** * p < 0,05 (контроль и 8РТ); ** p < 0,05 (контроль и 8РТ + LP-PRP + IGF) Положительные эффекты после применения LP- ние количества половых клеток, близкое к нормальному Морфометрические данные семенных канальцев в экспериментальных группах, p < 0,05 Количество половых клеток в семенных канальцах при облучении электронами разными дозами, при p < 0,05 PRP + IGF наблюдали уже на третьей неделе, а увеличе- значению, отмечали к концу исследования (на 42-е сутки). Рис. Семенник, морфологическая картина экспериментальных групп; окраска гематоксилином и эозином, увелич. *200. А - контроль; Б - на 7-е сутки после облучения (8 Гр, однократно); В - после облучения (8 Гр, однократно) и введения LP-PRP (на 35-е сутки) Гипосперматогенез является предпосылкой, часто приводящей к нарушению репродуктивной функции и, как следствие, бесплодию в супружеских парах [9]. Темой настоящего исследования впервые послужило изучение влияния факторов роста на гипосперматогенез после прицельного облучения семенников с использованием импульсного ускорителя электронов «NOVAC-11». Резкое снижение количества половых клеток (вследствие нарушения удвоения ДНК), возникшее уже через неделю после радиоактивного воздействия, сохранялось на протяжении всего эксперимента, что позволило многократно вводить LP-PRP + IGF животным III группы. Тем не менее, степень обнаруженных патоморфологических изменений структур семенника в дозе 8 Гр была значительно ниже, что является отличием от Y-облучения [4, 10]. Выбор срока эксперимента связан с длительностью физиологического сперматогенеза у крыс, в с р еднем составляющей 52 дня. Улучшению качественно-количественных характеристик половых клеток и их микроокружения в семеннике, согласно данным из литературных источников, способствует наличие различных факторов роста, которые стимулируют размножение и дифференцировку гамет, а также предотвращают апоптоз, поддерживая пролиферативно-апоптотический баланс [3]. В некоторых исследованиях LP-PRP уже была использована для восстановления сперматогенеза в модели бесплодия, однако полученные результаты оказались противоречивы. Mauduit и соавт. отметил, что при облучении животных в дозах радиации от 0,5 до 4 Гр экспрессия факторов роста снижалась [11]. В связи с этим, в нашем исследовании животным III группы дополнительно вводился IGF, учитывая его положительные эффекты на половые клетки. Введение животным только LP-PRP другими исследователями не дало подобного эффекта [4]. В модели гипосперматогенеза ростовые факторы LP-PRP, активированной CaCl2, в комбинации с IGF привели к активации низкодифференцированных сперматогоний B-типа и восстановлению пула половых клеток, что частично совпадает с данными других исследователей [4]. Количество клеток Сертоли и Лейдига на протяжении эксперимента во всех группах практически оставалось неизменным в связи с их сенсибилизацией к радиационному воздействию. Необходимо подчеркнуть, что для появления положительной динамики в семенниках крыс на фоне применения комбинации LP-PRP + IGF необходим правильный выбор концентрации и частоты введения LP-PRP и IGF. Из всего вышесказанного следует, что ионизирующее облучение семенников животных приводит к гипосперматогенезу, что может быть использовано при создании модели, экстраполированной на мужское бесплодие, а ростовые факторы плазмы, обогащенной тромбоцитами, могут послужить для улучшения LP-PRP-зависимых характеристик сперматогенеза. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Ростовые факторы плазмы, обогащенной тромбоцитами, в комбинации с IGF способствуют акти-вации низкодифференцированных сперматогоний и восстановлению пула половых клеток после облучения импульсным ускорителем электронов «NOVAC-11» в дозе 8 Грей.

About the authors

G. A Demyashkin

FSAEI HEI.M. Sechenov FirstMSMUMOH Russia (Sechenovskiy University); Medical Radiological Scientific Center named after A.F. Tsyba - branch of the National Medical Research Center of Radiology

Email: dr.dga@mail.ru

References

Supplementary files