IMMUNOHISTOCHEMICAL EVIDENCES OF MESENCHYMAL-EPITHELIAL AND EPITHELIAL-MESENCHYMAL TRANSITIONS IN EMBRYONIC AND POSTNATAL 123 LIVER MORPHOGENESIS

Full Text

Последние 20 лет активно изучается вопрос эмбриогенеза, поможет разработать новые подходы морфогенеза печени, что способствовало пониманию к лечению заболеваний печени. патогенеза многих заболеваний органа [1]. Понимание Гепатоциты составляют 78 % объема печени того, как этот сложный орган развивается во время млекопитающих [2] и вместе с холангиоцитами © Дворяшина И.А., Великородная Ю.И., Терентьев А.В., Загребин В.Л., 2022 представляют эпителиальный росток клеток в этом органе. К мезенхимальным клеткам печени относят синусоидальные эндотелиоциты, перисинусоидальные клетки печени, клетки Купфера и пит-клетки. Хотя большинство исследований традиционно сосредоточено на гепатоцитах, становится ясно, что негепато-цитарные типы клеток вносят решающий вклад в функцию и патологию печени, и усилия по пониманию их эмбрионального происхождения и механизмов их развития активизировались [3]. Эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) и его обратный процесс мезенхимально-эпителиальный переход (МЭП) - фундаментальные эволюционно консервативные механизмы, используемые на разных стадиях морфогенеза и органогенеза многоклеточных [4]. ЭМП включает прогрессирующую потерю полярности эпителиальных клеток, реорганизацию актинового цитоскелета, чтобы придать миграционный фенотип клеткам, которые дадут рост зародышевым листкам, а затем и тканям [5]. МЭП - это прогрессивное фенотипическое изменение от слабо связанных подвижных клеток к плотно связанным клеткам с отчетливой апикально-базальной полярностью, фундаментальный клеточный процесс, лежащий в основе ряда процессов развития, регенерации и патологии [6]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Определить иммуногистохимические признаки мезенхимально-эпителиального и эпителиально-мезенхимального переходов в эмбриональном и пост-натальном периодах развития печени. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Дизайн эксперимента. Исследование проводили на белых беспородных крысах массой 200-250 г. При постановке экспериментов руководствовались международными принципами гуманного обращения с животными, национальным законом и рекомендациями локального этического комитета. Крыс содержали в клетках по 8 особей в каждой в помещениях с искусственным освещением при 20-22 °С в условиях свободного доступа к воде и пище. Для исследования морфофункциональной характеристики клеток печени крыс на различных этапах онтогенеза производили забор образцов печеночной ткани на 10-й и 17-й день эмбрионального (антенатального) периода развития, а также в 1-й и 14-й дни постнатального периода развития животных. В качестве контроля служили образцы печени взрослых лабораторных крыс. JOURNAE OF VOLGOGRAD STATE j MEDICAL UNIVERSITY Иммуногистохимический метод исследования. Парафиновые срезы образцов тканей толщиной 5 мкм для иммуногистохимического исследования монтировали на стекла, обработанные поли-1_-лизином (Menzel). Для определения локализации Цитокератина-18 применяли кроличьи моноклональные (С-04) антитела (Novusbio, Канада), для изучения виментина -кроличьи моноклональные (V9) антитела (Invitrogen, США). Для блокирования эндогенной пероксидазы срезы инкубировали 20 минут в 3 % перекиси водорода. Постановку иммуногистохимических реакций проводили с помощью пероксидаза-полимерной системы визуализации по стандартному протоколу производителя (Dako, США). Демаскировку антител осуществляли путем кипячения срезов при 100 °С в цитратном буфере (рН = 6,0) в течение 10 минут. Пероксидазу проявляли 3-3-диаминобензидином из набора протокола. На заключительном этапе реакции срезы докрашивали гематоксилином Майера. Негативным контролем служили препараты без инкубации с первичными антителами при полном соблюдении остальных этапов протокола. Морфометрия. Препараты изучали и фотографировали с помощью микроскопа AxioScope (ZEISS, Германия), оборудованного цифровой камерой AxioCam506 color (ZEISS, Германия). Относительную площадь, занимаемую цитокератиновыми и вименти-новыми филаментами, обсчитывали с помощью программ ZEN 2012 (ZEISS, Германия) и Image-Pro Plus. Статистика. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы Statistica 6.0 (StatSoft, США). Рассчитывались параметры среднего арифметического значения (М) и стандартного отклонения (SD). Сравнения между группами проводили с помощью непараметрического анализа с использованием U критерия Манна - Уитни. Различия считали значимыми при P ^ 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Иммунолокализация виментина в эмбриональном и постнатальном периодах развития печени. Вимен-тиновые промежуточные филаменты поддерживают целостность клеток и участвуют в миграции, подвижности и адгезии клеток [7]. Помимо этого, приобретение виментина является характерным признаком эпителиально-мезенхимального перехода [8]. Иммуногистохимическое исследование ткани печени взрослых крыс показало, что характерная положительная реакция на виментин регистрировалась в перисинусоидальных клетках и клетках Купфера, стенках желчных канальцев, а также в эпителиальных клетках желчных протоков и эндо-телиоцитах сосудов (рис. 1Д). В ткани печени 10-суточных зародышей помимо отложений виментина в эндотелиоцитах и холангио-цитах обнаружили иммунопозитивные недифференцированные мезенхимальные клетки печени и единичные клетки с фенотипом гепатобластов, содержащих гранулы виментина. Наличие гранул виментина в гепато-бласте может говорить о происхождении этих клеток путем МЭП [8] (рис. 1А). Относительная площадь виментина на препаратах печени 10-суточных зародышей крыс была значимо (р < 0,01) выше, чем на препаратах печени взрослых животных, вероятно из-за гепатобластического типа кроветворения у зародышей (рис. 3). В ткани печени 17-суточных зародышей крыс помимо иммунопозитивных депозитов виментина в эндотелиоцитах синусоидов, портальных артериол и венул, центральных вен и в холангиоцитах, JOURNAL ОГ VOLGOGRAD STATE MEDICAL UNIVERSITY обнаружили малодифференцированные гепатоциты с пылевидными иммунопозитивными включениями виментина в цитоплазме, что может рассматриваться как признак МЭП на завершающей стадии (рис. 1Б). Относительная площадь виментина на препаратах печени 17-суточных зародышей крыс также была достоверно (р < 0,01) выше, чем на препаратах печени взрослых животных (рис. 3). У суточных крысят виментин обнаруживали в эндотелиоцитах сосудов, перисинусоидальных клетках, гепатобластах и гепатоцитах (рис. 16). У 14-суточных крысят устанавливается характерное для взрослых животных распределение виментина в ткани печени: все реже недеференцированные мезенхимальные клетки и виментин-позитивные гепатоциты (рис. 1Г). При этом относительная площадь виментина на препаратах печени суточных и 14-суточных крысят не отличалась достоверно от относительной площади на препаратах печени взрослых животных (рис. 3). Т7 • V X • • /•99■У"' 9 ** V I > • «Г г *1» , чф, Ив? .( *■*,. gjt. \\''' «м ' •’ 'V, ' и %и Vbi.'*' ” v.A f: ff -Ai' ay - d f >. ■■ A . tyинг, 4, v; - Рис. 1. Динамика распределения виментина в ткани печени крыс: А - 10-суточного зародыша крысы; Б - 17-суточного зародыша крысы; В - суточной крысы; Г - 14-суточной крысы; Д - взрослой крысы. Иммуногистохимическая реакция с антителами к виментину. Докраска ядер гематоксилином Майера. Ув. *200 Иммунолокализация цитокератина 18 в эмбриональном и постнатальном периодах развития печени Цитокератин 18 (ЦК18) - это основной эпителиально-специфический промежуточный филамент печени, который синтезируют зрелые гепатоциты и холан-гиоциты [10]. Также в нормальной ткани печени взрослых животных ЦК18 определяли в эндотелиоцитах кровеносных сосудов, цитоплазматических мембранах и цитоплазме гепатоцитов. Отмечали яркоокрашенные малодифференцированные гепатоциты в области портальных триад (рис. 2Д). В ткани печени 10-суточных зародышей крыс обнаружили клетки неправильной формы с фенотипом гепатобластов и крупными иммунопозитивными гранулами по всей цитоплазме и в околомембранном положении (рис. 2А). Наличие крупных гранул ЦК18 в цитоплазме гепатоцитов не является типичным расположением данного белка в ткани печени взрослых крыс. Относительная площадь ЦК18 на препаратах печени 10-суточных зародышей крыс была статистически достоверно ниже (р < 0,01), чем на препаратах печени взрослых животных, вероятно из-за большого количество бластных мезенхимальных клеток (рис. 3). К 17-м суткам эмбрионального развития расположение ЦК18 у части клеток появляются свойственные гепатоцитам иммуногистохимические признаки, что указывает на неравномерную скорость созревания клеток (рис. 2Б). Относительная площадь ЦК18 на препаратах печени 17-суточных зародышей крыс была достоверно ниже (р < 0,01), чем на препаратах JOURNAL OF VOLGOGRAD STATE j MEDICAL UNIVERSITY печени взрослых животных, и при этом она была также статистически достоверно выше (р < 0,01), как на препаратах печени 10-суточных зародышей (рис. 3). Наблюдаемые изменения относительной площади являются следствием увеличения эпителиальных клеток не только в размере, но и в их количестве по отношению к мезенхимальным клеткам. В клетках печени суточных и 14-суточных крыс определили характерное для зрелых гепатоцитов распределение ЦК18 - в виде преимущественно мембранной формы (рис. 2В, Г). При этом относительная площадь виментина на препаратах печени суточных и 14-суточных крыс была достоверно ниже, чем на препаратах печени взрослых крыс, что может объясняться сохранением недифференцированных клеток и разной плотностью распределения гепатоцитов в тканях печени крысят и взрослых особей (рис. 3). Рис. 2. Динамика распределения цитокератина 18 в ткани печени крыс: А - 10-суточного зародыша крысы; Б - 17-суточного зародыша крысы; В - суточной крысы; Г - 14-суточной крысы; Д - взрослой крысы. Иммуногистохимическая реакция с антителами к цитокератину 18. Докраска гематоксилином Майера. Ув. *200 Динамика соотношения виментина и цитокератина 18 на различных этапах онтогенеза как доказательство мезенхимально-эпителиального и эпителиальномезенхимального переходов в ткани печени Провели количественный анализ динамичес-ких изменений относительной площади виментин -позитивных и цитокератин-позитивных клеток, для дополнительной характеристики МЭП при гепатоге-незе (рис. 3). Обращало на себя внимание снижение относительной площади виментина с 13 % на 10-й день эмбрионального развития к 4,47 % на момент рождения, что происходило на фоне снижения кроветворной функции печени, к 14-му дню после рождения относительная площадь виментина незначительно повышалась до 6,13 % и затем снижалась у взрослых особей до 5,66 %. Напротив, частота эпителиальных цитокератин-позитивных клеток повысилась с 17,7% относительной площади на 10-й день эмбрионального развития до 23,8 % на момент рождения, затем незначительно понизилась до 22,4 % на 17-й день после рождения и окончательно возросла до 33,7 % у взрослых особей (рис. 3, гистограмма). Снижение отношения виментин/цитокератин 18 (рис. 3, динамическая кривая) от 10-го дня эмбрионального развития до рождения свидетельствовалоо повышенной экспрессии эпителиальных генов относительно мезенхимальных, на что указывало превалирование ЦК18 над виментином, подтверждая таким образом МЭП в процессе эмбрионального развития печени [1]. В ткани печени на 17-й день после рождения отмечали увеличение содержания мезенхимальных белков относительно эпителиальных, что могло быть следствием образования мезенхимальных клеток печени из недифференцированного мезенхимального ростка и/или гепатобластов путем ЭМП (рис. 3, динамическая кривая). В то же время в ткани печени у взрослых особей отмечали снижение отношения виментин/цитокератин 18, вероятно, вследствие пролиферации клеток эпителиального ростка (в первую очередь гепатоцитов). Рис. 3. Динамика соотношения относительной площади виментина и цитокератина на этапах онтогенеза ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, выявлены иммуногистохимиче-ские признаки мезенхимально-эпителиального и эпителиально-мезенхимального переходов в эмбриональном и постнатальном морфогенезе печени. Мезенхимально-эпителиальный переход является одним из возможных путей образования эпителиальных клеток печени на первых этапах эмбриогенеза. Эпителиальный росток клеток проявляет признаки зрелости уже к первым суткам после рождения, тогда как мезенхимальный росток созревает позднее. К 14-му дню после рождения возрастает число мезенхимальных клеток печени, что может говорить о происхождении части мезенхимальных клеток путем эпителиально-мезенхимального перехода. На основании полученных данных можно сделать вывод, что в морфогенезе печени мезенхимально-эпителиальный переход после рождения сменяется эпителиальномезенхимальным переходом.

About the authors

Irina A. Dvoryashina

Volgograd State Medical University

Postgraduate Student of the Department of Histology, Embryology, Cytology Volgograd, Russia Volgograd

Yulia I. Velikorodnaya

Volgograd Medical Research Center

Email: alta-u@mail.ru
Postgraduate Student of the Department of Pharmacology and Pharmacy, Institute of Continuing Medical and Pharmaceutical Education, Volgograd State Medical University, Researcher at the Laboratory of Pathomorphology, Volgograd Medical Research Center Volgograd, Russia Volgograd

Andrey V. Terentyev

Volgograd State Medical University

Email: kocha.2009@yandex.ru
Postgraduate Student of the Department of Histology, Embryology, Cytology Volgograd, Russia Volgograd

Valery L. Zagrebin

Volgograd State Medical University

Email: vlzagrebin@volgmed.ru
Candidate of Medical Sciences, Associate Professor, Head of the Department of Histology, Embryology, Cytology Volgograd, Russia Volgograd

References

Supplementary files