EFFECT OF DIRECT ORAL ANTICOAGULANTS ON THE HEMOSTASIS SYSTEM 142 IN BACTERIAL SEPSIS


Cite item

Full Text

Abstract

The inflammatory reaction that arises in patients with sepsis is interconnected with the coagulation system and leads to the development of hypercoagulable changes in the body. Therefore, in this study, we studied the effect of direct oral anticoagulants dabigatran etexilate and apixaban on the hemostasis system without and under conditions of a systemic inflammatory response. Hypercytokinemia was created by intravenous administration of lipopolysaccharide into the tail vein of a rat. The anticoagulant activity of the studied drugs was assessed by their effect on the parameters of the rat blood coagulogram. Dabigatran etexilate showed a pronounced antithrombin effect, increasing the thrombin time by 10.5 times relative to the control in intact animals. Under conditions of hypercytokinemia, this activity increased by 12.8 times. Apixaban did not cause changes in thrombin time, but it increased the prothrombin time index both in intact animals and animals with a systemic inflammatory response by 7 and 8.6 times, respectively. Thus, an increase in the anticoagulant effect of dabigatran etexilate and apixaban under conditions of hypercytokinemia indicates that they may have anti-inflammatory activity.

Full Text

Частым осложнением протекания вирусных и бак- характеризуемой быстрой пролиферацией и повышен-териальных заболеваний является гиперцитокинемия, ной активностью T-клеток, макрофагов и естественных связанная с выраженной реакцией иммунной системы, киллеров с высвобождением защитными клетками © Спасов А.А., Кучерявенко А.Ф., Сиротенко В.С., Гайдукова К.А., Усков Г.М., 2022 различных воспалительных цитокинов и химических медиаторов [1]. Данное состояние вызывает повреждение эндотелия легочных сосудов и нарушение всех его защитных функций, так как снижается выделение оксида азота и PGI2, которые подавляют активацию и адгезию лейкоцитов. Генерация тромбина приводит к образованию фибрина, активации тромбоцитов и эндотелиальных клеток через PAR-1 рецепторы, что вызывает увеличение фактора фон Виллебранда (VWF), усиливает воспаление, вызывая активацию Р-селектина, активирует лейкоциты и гладкие мышцы эндотелия, что приводит к развитию цитокинового шторма [2, 3]. Следовательно, системная дисфункция эндотелия и коагулопатия при вирусных и бактериальных инфекциях ассоциированы с повышением риска летального исхода [4, 5]. Необходимо отметить, что одним из схожих с цитокиновым штормом патологических состояний является сепсис, патофизиология которого сложна и сопровождается внутрисосудистой коагуляцией, вызванной иммунным ответом организма хозяина [6]. В норме это так называемая иммунокоагуляция, которая является частью врожденного иммунитета и может служить первой линией защиты от инфекции. Кроме того, доклиническими и клиническими исследованиями подтверждена патологическая роль инициатора внешнего пути - тканевого фактора в возникновении эндотоксемии [7, 8]. В экспериментах было показано, что экзогенный липополисахарид (ЛПС) через толл-подобный рецептор 4 (TLR4 - Toll-Like receptor) вызывает высвобождение и экспрессию тканевого фактора на поверхности клеток и приводит к септической смерти мышей [9, 10]. Следовательно, биологические мишени, которые используются для фармакотерапии септических состояний, можно рассматривать и как варианты для борьбы с цитокиновым штормом и внутрисосудистой коагуляцией. Именно поэтому использование соединений с антикоагулянтным эффектом для терапии цитоки-нового шторма представляется актуальным в современной эпидемиологической обстановке. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Изучение влияния прямых оральных антикоагулянтов на систему гемостаза без и в условиях гипер-цитокинемии. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты выполнены на 35 белых беспородных крысах-самцах массой 250-270 г, полученных из питомника ООО «НИЦБМТ» (г. Москва) и содержащихся в условиях вивария (температура 22-24 °С, относительная влажность воздуха 40-50 %) с естественным световым режимом на стандартной диете JOURNAL О Г VOLGOGRAD STATE MEDICAL UNIVERSITY (ГОСТ Р 50258-92) при соблюдении правил лабораторной практики проведения доклинических исследований в РФ (ГОСТ З 51000.3-96 и 1000.4-96), а также правил и Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (1997). Эксперименты были одобрены региональным исследовательским Этическим комитетом Волгоградской области (справка № 2021/056 от 15.06.2021 г.). Данное исследование выполнено в соответствии с требованиями действующего «Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (под ред. Миронова А.Н., 2012 г.) [11]. Для достижения поставленной цели были сформированы группы опытных и контрольных крыс. В качестве объектов исследования были изучены прямые оральные антикоагулянты дабигатрана этексилат (Берингер Ингельхайм Фарма ГмбХ и Ко., Германия) и апиксабан (Бристол-Майерс Сквибб Мэнюфэкччуринг Компани, Пуэрто-Рико), которые вводились однократно внутрижелудочно при помощи атравматичного гастрального зонда в дозах, эквивалентных дозам для человека с учетом межвидового коэффициента пересчета. Эти дозы для дабигатрана этексилата составили 12 мг/кг; для апиксабана - 0,4 мг/кг. Гиперцитокинемию создавали внутривенным введением липополисахарида (ЛПС, E. coli O111:B4, Sigma, США) в дозе 2 мг/кг [12] в хвостовую вену крысы. ЛПС вводили через время достижения референсными препаратами максимальной концентрации в крови. Для дабигатрана этексилата оно составило 2 часа, для апиксабана - 3 часа. Забор крови для исследования осуществляли через 4 часа после введения ЛПС. Влияние референсных препаратов и новых соединений на показатели коагулограммы крови крыс определяли хронометрически, на гемокоагулометре «SOLAR» (Белоруссия) с использованием наборов реактивов производства («Технология-стандарт», Россия), методиками, которые основаны на автоматическом определении клоттингового времени (время свертывания). Для калибровки прибора и проведения тестов использовалась нормальная калибровочная плазма. Кровь для исследования забирали из брюшной аорты крыс, которых предварительно наркотизировали (хлоралгидрат 400 мг/кг внутрибрюшинно). Для стабилизации крови использовали 3,8%-й водный раствор цитрата натрия (pH 6,0) в соотношении 9:1. Все коагуляционные анализы проводились на бедной тромбоцитами плазме крыс, которую получали путем центрифугирования богатой тромбоцитами плазмы при 3000 об./мин в течение 15 мин [13]. Препараты изучали в концентрации 100 мкМ. Оценку антикоагулянтной активности проводили по их влиянию на параметры коагулограм-мы крови крыс: активированное частичное тромбопла-стиновое время (АЧТВ), тромбиновое и протромбиновое время (ТВ и ПТВ соответственно). Для всех данных применяли описательную статистику с использованием подходящих критериев, которые представлены в итоговых таблицах. Вариационностатистическую обработку результатов проводили с использованием критерия one-way ANOVA с поправкой Бонферрони при помощи программы GraphPad Prism 8.0. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Изучение воздействия референсных препаратов на коагуляционные характеристики крови интактных крыс in vivo представлено в табл. 1. JOURNAL OF VOLGOGRAD STATE j MEDICAL UNIVERSITY Так, в контроле показатель АЧТВ составил 38,3 с. При этом препараты дабигатрана этексилат и апиксабан в исследуемых дозах достоверно удлиняли данный показатель в 3,6 и 1,3 раза соответственно (р < 0,05). Тромбиновое время в крови крыс в контроле составило 57,7 с. Препарат дабигатрана этексилат оказал выраженное антитромбиновое действие, увеличивая данный показатель в 10,5 раз р < 0,05). При этом апиксабан не изменял данный показатель. Показатель протромбинового времени в группе контрольных животных составил 28,1 с. Дабигатрана этексилат не оказывал влияния на данный параметр. Препарат апиксабан достоверно увеличивал протромбиновое время до 198,6 с р < 0,05), что в 7 раз превышает контрольные значения. Таблица 1 Влияние прямых антикоагулянтов дабигатрана этексилата на показатели коагулограммы крыс при однократном внутрижелудочном введении (M ± m) (n = 5) Тестируемый образец Доза, мг/кг Параметры коагулограммы АЧТВ, с ТВ, с ПТВ, с Контроль - интактные животные - 38,3 ± 1,7 57,7 ± 3,8 28,1 ± 1,4 Дабигатрана этексилат 2,01 137,53 ± 2,79' 603,9 ± 18,2' 31,20 ± 1,17 Апиксабан 0,41 49,8 ± 1,2' 61,3 ± 2,9 198,6 ± 4,8' 1Доза, полученная путем перерасчета с использованием межвидового коэффициента; “данные достоверны относительно контроля, критерий one-way ANOVA p < 0,05). В условиях гиперцитокинемии контрольный показатель АЧТВ составил 18,4 с, что в 2,1 раза меньше по сравнению с данным параметром у интактных животных. При этом дабигатрана этексилат и апиксабан также статистически значимо увеличивали данный параметр в 2,2 и 1,3 раза соответственно р < 0,05) (табл. 2). При системной воспалительной реакции показатель тромбинового времени уменьшался в 1,3 раза по сравнению с контрольной группой интактных крыс, что свидетельствует об активации коагуляционного звена гемостаза. Препарат дабигатрана этексилат пролонгировал данный параметр в 12,8 раза (р < 0,05). При этом апиксабан не оказывал влияния на тромбиновое время (табл. 2). Протромбиновое время в группе контрольных животных статистически значимо не изменялось относительно данного параметра у интактных крыс. Дабигатрана этексилат не влиял на данный параметр, а апиксабан пролонгировал протромбиновое время в 8,6 раза относительно контроля (р < 0,05) (табл. 2). Таблица 2 Влияние прямых антикоагулянтов дабигатрана этексилата на показатели коагулограммы крыс в условиях гиперцитокинемии при однократном внутрижелудочном введении (M ± m) (n = 5) Тестируемый образец Доза, мг/кг Параметры коагулограммы АЧТВ, с ТВ, с ПТВ, с Контроль - интактные животные - 38,3 ± 1,7 57,7 ± 3,8 28,1 ± 1,4 Контроль - введение ЛПС - 18,4 ± 0,8# 44,1 ± 1,7# 21,2 ± 1,3 Дабигатрана этексилат 12,01 41,0 ± 2,0* 566,1 ± 45,5* 31,1 ± 1,0 Апиксабан 0,41 23,9 ± 2,5 46,2 ± 2,5 185,6 ± 4,7* 1Доза, полученная путем перерасчета с использованием межвидового коэффициента; *данные достоверны относительно контроля с ЛПС, критерий ANOVA p < 0,05); #данные достоверны относительно интактного контроля. Воспалительная реакция, возникающая у больных сепсисом, всегда взаимосвязана с системой коагуляции и приводит к развитию гиперкоагуляционных изменений в организме. Эндотелий сосудов совместно с макрофагами, моноцитами и нейтрофилами играет не только важную роль в борьбе с инфекцией, но и сам может вызывать повреждения посредством выброса цитоки-нов, приводя, таким образом, к органной дисфункции. Активация моноцитов или макрофагов ткани связана с ЛПС клеточной стенки микроорганизмов, что приводит к выбросу медиаторов воспаления и коагуляции [14]. Выброс медиаторов приводит к дополнительному повреждению эндотелия и стимулированию работы моноцитов. Эти аутокринные и паракринные пути создают положительную петлю обратной связи, приводящую к увеличенному выбросу макрофагами и клетками эндотелия тканевого фактора, прокоагулянта и про-адгезивного фактора эндотелиальной стенки [15]. Среди средств для предотвращения тромбозов при данной патологии лидирующее место занимают антикоагулянты [16]. В связи с этим было изучено влияние новых оральных антикоагулянтов на параметры коагуляционного гемостаза крыс без и в условиях системной воспалительной реакции. В результате было показано, что препарат дабигатрана этексилат на интактных животных оказывает выраженное анти-тромбиновое действие, что подтверждает механизм его антикоагулянтного действия, а именно ингибирование IIa фактора (тромбин). В условиях гиперцитокинемии активность данного препарата увеличивается в 1,2 раза, что свидетельствует о его возможном влиянии на другие патогенетические механизмы иммунокоагуляции. Препарат апиксабан, являясь ингибитором Xa фактора, также в условиях системной воспалительной реакции увеличивает свою активность, пролонгируя протромбиновое время. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, усиление антикоагулянтного действия дабигатрана этексилата и апиксабана в условиях системной воспалительной реакции указывает на возможное наличие у них противовоспалительной активности. Следовательно, новые оральные антикоагулянты могут внести существенный вклад, влияя на патогенетические звенья иммунокоагуляции и тем самым снижая риск развития тромбозов.
×

About the authors

Alexander A. Spasov

Volgograd State Medical University

Email: aspasov@mail.ru
Academician of the Russian Academy of Sciences, Doctor of Medical Sciences, Professor, Head of the Department of Pharmacology and Bioinformatics Volgograd, Russia

Aida F. Kucheryavenko

Volgograd State Medical University

MD, Associate Professor, Professor of the Department of Pharmacology and Bioinformatics Volgograd, Russia

Viktor S. Sirotenko

Volgograd State Medical University

Email: sirotenko.viktor@yandex.ru
Candidate of Pharmaceutical Sciences, Associate Professor of the Department of Pharmacology and Bioinformatics Volgograd, Russia

Ksenia A. Gaidukova

Volgograd State Medical University

Email: ksenijagaidukva@rambler.ru
Candidate of Medical Sciences, Associate Professor of the Department of Pharmacology and Bioinformatics Volgograd, Russia

Georgy M. Uskov

Volgograd State Medical University

Email: pyshok34@gmail.com
Postgraduate Student of the Department of Pharmacology and Bioinformatics Volgograd, Russia

References

  1. Current and future developments in the treatment of virus-induced hypercytokinemia /j.P. Wong, S. Viswanathan, M. Wang [et al.] // Future Medicinal Chemistry. 2017. Vol. 9(2). P. 169-178. doi: 10.4155/fmc-2016-0181.
  2. Mitchell W.B. Thromboinflammation in COVID-19 acute lung injury // Paediatric Respiratory Reviews. 2020. No. 35. P. 20-24.
  3. Fajgenbaum D.C., June C.H. Cytokine Storm // New England Journal of Medicine. 2020. Vol. 383 (23). P. 2255-2273. https://doi.org/10.1056/NEJMra2026131.
  4. High incidence of venous thromboembolic events in anticoagulated severe COVID-19 patients /j.F. Llitjos, M. Leclerc, C. Chochois [et al.] //j. Thromb. Haemost. 2020. Vol. 18(7). P. 1743-1746. doi: 10.1111/jth.14869.
  5. Confirmation of the high cumulative incidence of thrombotic complications in critically ill ICU patients with COVID-19: an updated analysis / F.A. Klok, M.J.H.A. Kruip, NJ.M. van der Meer [et al.] // Thromb. Res. 2020. No. 191. P. 148-150. doi: 10.1016/j.thromres.2020.04.041.
  6. Behrens E.M., Koretzky G. A. Review: Cytokine Storm Syndrome: Looking Toward the Precision Medicine Era // Arthritis & Rheumatology. 2017. Vol. 69 (6). P. 1135-1143. doi: 10.1002/art.40071.
  7. Role of tissue factor and protease activated receptors in a mouse model of endotoxemia / R. Pawlinski [et al.] // Blood. 2004. No. 103. P. 1342-1347.
  8. Inflammasome activation triggers blood clotting and host death through pyroptosis / C. Wu [et al.] // Immunity. 2019. No. 50. P. 1401-1411.
  9. Bacterial endotoxin activates the coagulation cascade through gasdermin D-dependent phosphatidylserine exposure / X. Yang [et al.] // Immunity. 2019. No. 51. P. 983-996
  10. TMEM173 drives lethal coagulation in sepsis / H. Zhang [et al.] // Cell Host Microbe. 2020. No. 27. P. 556-570.
  11. Методические рекомендации по изучению лекарственных средств, влияющих на гемостаз / В.А. Макаров, АА. Спасов, М.Б. Плотников [и др.] // Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств ФГБУ «НЦЭСМП» Минздравсоцразвития России. М., 2012. С. 453-479.
  12. Prolonged Neuroinflammation after Lipopolysaccharide Exposure in Aged Rats / H. Oun Fu, T. Yang, W. Xiao [et al.] // PLoS One. 2014. Vol. 9(8). P. 106331.
  13. Люсов В.А., Белоусов Ю.Б. Метод графической регистрации агрегации тромбоцитов и изменения ее при ишемической болезни сердца // Кардиология. 1971. № 8. С. 459-461.
  14. Aird W.C. Targeting the endothelium in sepsis and multiorgan dysfunction // Sci. Med. (Phila). 2003. Vol. 9. P 108-119.
  15. Hotchkiss R.S., Karl I.E. The pathophysiology and treatment of sepsis // N. Engl. J. Med. 2003. Vol. 348. P. 138-150.
  16. Anticoagulant treatment is associated with decreased mortality in severe coronavirus disease 2019 patients with coagulopathy / N. Tang, H. Bai, X. Chen [et al.] //j. Thromb. Haemost. 2020. Vol. 18 (05). P. 1094-1099.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2022 Spasov A.A., Kucheryavenko A.F., Sirotenko V.S., Gaidukova K.A., Uskov G.M.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 79562 от 27.11.2020 г.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies