EFFECT OF GABA AND GLUTAMIC ACID DERIVATIVES ON THE FUNCTIONAL ACTIVITY OF LIVER CELL MITOCHONDRIA IN VITRO 147 UNDER CONDITIONS OF OXIDATIVE STRESS

Full Text

Согласно данным современных исследований в основе развития многих неинфекционных заболеваний, таких как нейродегенеративные, сердечно-сосудистые, эндокринные и другие, лежит тканевое повреждение, связанное с митохондриальной дисфункцией [1] и активацией свободно-радикальных реакций [2, 3]. В физиологических условиях свободно-радикальное окисление находится под контролем антиокси-дантной системы, однако воздействие неблагоприятных факторов внешней и внутренней среды способно сместить равновесие в сторону интенсификации окислительных процессов, что приводит к недостаточности антиоксидантной защиты и избыточному © Хусайнова Г.Х., Попова Т.А., Кустова М.В., Островский О.В., 2022 производству активных форм кислорода (АФК), то есть к окислительному стрессу. Согласно литературным данным основным источником окислительного повреждения выступает митохондриальная цепь переноса электронов, при этом наибольшее количество АФК образуется в I комплексе [4]. Воздействие высоких концентраций АФК способно вызвать разобщение процессов окисления и фосфорилирования за счет уменьшения электрохимического градиента и снизить уровень синтеза АТФ в митохондриях, несмотря на ускорение движения электронов по дыхательной цепи и усиление катаболизма органических соединений [5]. Гипоэнергети-ческое состояние на фоне гиперметаболизма может индуцировать апоптоз или даже в некоторых случаях приводить к гибели клеток [6]. Таким образом, митохондрии могут выступать специфической мишенью для поиска фармакологических субстанций, способных нормализовать энергетический обмен и ограничивать производство свободных радикалов в клетках. ЦЕЛЬ РАБОТЫ В ранее проведенных исследованиях было установлено кардио- и нейропротекторное действие производных ГАМК [7, 8, 9]. Учитывая, что ведущую роль в патогенезе заболеваний сердца и мозга играет дисфункция митохондрий и окислительный стресс, представлялось целесообразным изучение влияния производных ГАМК на функциональную активность интактных и поврежденных окислительным стрессом митохондрий. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты были выполнены на 16 белых нелинейных крысах массой 250-300 г. После гильотинирования у крыс извлекали печень, промывали ее ледяным физиологическим раствором, измельчали ножницами и гомогенизировали на льду в стеклянном гомогенизаторе Поттера - Эльвейема с добавлением среды выделения, содержащей 220 мМ маннита, 100 мМ сахарозы, 1мМ ЭДТА, 4мМ KH2PO4, 20мМ HEPES, pH = 7,3 в соотношении 1:5. Все этапы выделения митохондрий проводили при температуре 4 °С (камера холодильная «КХС-2»). Полученный гомогенат центрифугировали 10 мин с охлаждением (центрифуга «К-23», Германия) при 2000 g для осаждения клеточного дебриса и неразрушенных клеток. Отбирали надосадочную жидкость и вновь центрифугировали с охлаждением 20 мин при 8000 g. Супернатант сливали, осадок ресуспендировали в 1 мл среды выделения, переносили в эппендорфы и использовали в качестве фракции митохондрий. Суспензию митохондрий хранили на холоде до окончания работы [10]. JOURNAL OF VOLGOGRAD STATE j MEDICAL UNIVERSITY Выделенные митохондрии сначала были разделены на две группы: 1-я - интактные, инкубировали с 0,9%-м раствором NaCL в течение 10 мин; 2-я - поврежденные, инкубировали с окислителем -трет-бутилгидропероксидом (ГПТБ) в концентрации 200 нмоль/мл в течение 10 минут. Затем каждую группу разделили на 9 частей и добавляли исследуем ые соединения в концентрации 1*10-5 Mна 100 мкл митохондриальной фракции и инкубировали еще 10 мин на холоде. Таким образом, получилось 18 групп: 1-я - интактная; 2-я - контрольная (поврежденные); 3-10 - опытные группы - интактные митохондрии, инкубированные с баклофеном, мефебутом, нейро-глутамом, соединением РГПУ-238, салифеном, толи-бутом, фенибутом, фенотропилом; 11-18 - опытные группы - поврежденные митохондрии, инкубированные с изучаемыми соединениями в том же порядке. Скорость поглощения кислорода определяли полярографическим методом (полярограф «Hansatech», Великобритания) и выражали в нмольО2/мин/мг белка. Концентрацию белка определяли методом Лоури. Полярографическую ячейку заполняли термостатированной при 33 оС, насыщенной кислородом средой полярографии, вносили суспензию митохондрий (100 мкл), в течение 40 с - 1 мин измеряли базальное дыхание митохондрий (V1 по Чансу). С помощью автоматической микропипетки в закрытую ячейку вносили субстраты I (10 мМ малат в присутствии 10 мМ глутамата) и II комплексов (сукцинат 10 мМ), регистрировали скорость поглощения кислорода 40 с -1 мин. Затем в ячейку вносили 2,5 мМ АДФ (для максимального стимулирования дыхания) и регистрировали поглощение кислорода в состоянии V3 по Чансу в течение 1-1,5 мин. После исчерпания АДФ регистрировали дыхание митохондрий в состоянии V4. Статистическую обработку результатов проводили с помощью критериев Манна - Уитни, Стьюдента и Ньюмена - Кейлса. Статистически значимыми считали различия при p < 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Было установлено, что некоторые исследуемые производные ГАМК и глутаминовой кислоты оказывали влияние на дыхательную функцию интактных митохондрий печени in vitro. Скорость АДФ-индуцированного дыхания при одновременном окислении малат/глутамата и сукцината в митохондриях, инкубированных с салифеном и фенотропилом, была на 23 % (р < 0,05) и 18 % (р < 0,05) больше, чем у интактной группы митохондрий (табл.). Баклофен, мефебут, нейроглутам, толибут, соединение РГПУ-238 и фенибут при инкубировании с интактными митохондриями незначительно снижали V3. Скорость потребления кислорода в дыхательной цепи после исчерпания АДФ в митохондриях, инкубированных с салифеном, повышалась на 27 % (р < 0,05) относительно контрольной группы. В других исследуемых группах достоверных отличий в показателе V4 не было выявлено. Для оценки сопряженности процессов окисления и фосфорилирования был рассчитан коэффициент дыхательного контроля (ДК) как соотношение скоростей V3/V4. Данный параметр наиболее полно характеризует функциональное состояние митохондрий и отражает их способность производить АТФ в количестве, соответствующем энергетическим потребностям клеток. Кратковременное воздействие ГПТБ на митохондрии приводило к снижению скорости АДФ-индуци-рованного потребления кислорода на 28 % (р < 0,05) по сравнению с показателями интактной группы (рис. 1). Салифен повышал V3 поврежденных митохондрий на 54 % (р < 0,05), фенотропил - на 43 % (р < 0,05), мефебут - на 29 % (р < 0,05), нейроглутам на 26 % (р < 0,05), толибут - на 22 % (р < 0,05), фенибут -на 21 % (р < 0,05) относительно митохондрий клеток печени животных контрольной группы. Соединение РГПУ-238 и баклофен не оказывали значительного влияния на данный показатель. Скорость потребления кислорода в контрольной группе, поврежденной ГПТБ, в состоянии V4 была JOURNAL ОГ VOLGOGRAD STATE MEDICAL UNIVERSITY Было установлено, что кратковременное воздействие фенотропила на интактные митохондрии клеток печени приводит к повышению ДК на 12 % (р < 0,05), салифен не влияет на данный показатель (табл.). При инкубировании митохондрий с остальными изучаемыми препаратами, наоборот, наблюдалось разобщение между дыханием и фосфорилированием. Под влиянием соединения РГПУ-238 и баклофена дыхательный контроль снижался на 26 % (р < 0,05) и на 20 % (р < 0,05) соответственно, в остальных исследуемых группах наблюдалось недостоверное снижение по сравнению с интактной группой. на 35 % (р < 0,05) выше, чем у интактной, что может указывать на утечку электронов в дыхательной цепи (рис. 2). При этом под влиянием изучаемых соединений наблюдалось снижение данного показателя, наиболее выраженное для фенотропила. Показатель ДК в митохондриях контрольной группы был на 48 % (р < 0,05) ниже, чем в интактных м итохондриях, что подтверждает повреждающее действие ГПТБ (рис. 3). Инкубирование митохондрий, поврежденных трет-бутилгидропероксидом, с исследуемыми соединениями способствовало усилению сопряжения процессов окисления и фосфорилирования, что выражалось увеличением коэффициента ДК относительно контрольной группы. Так, фенотропил Влияние производных ГАМК и глутаминовой кислоты на функциональную активность интактных митохондрий печени крыс № Группы V3 нмоль О2 /мин/мг белка V4 нмоль О2 /мин/мг белка ДК (V3/V4) 1 Интактная 85,04 ± 7,13 28,43 ± 3,86 3,04 ± 0,43 2 Интактная + баклофен (%) 66,07 ± 10,8“ (-22) 26,92 ± 3,49 (-5) 2,44 ± 0,16“ (-20) 3 Интактная + мефебут (%) 79,43 ± 13,96 (-7) 29,50 ± 7,35 (± 4) 2,77 ± 0,52 (-9) 4 Интактная + нейроглутам (%) 76,48 ± 5,01“ (-10) 29,99 ± 6,48 (± 6) 2,65 ± 0,58 (-13) 5 Интактная + РГПУ-238 (%) 64,17 ± 11,8“ (-25) 28,83 ± 5,80 (± 2) 2,25 ± 0,32“ (-26) 6 Интактная + салифен (%) 104,87 ± 26,60 (± 23) 36,02 ± 13,0“ (± 27) 3,09 ± 0,70 (± 2) 7 Интактная + толибут (%) 76,07 ± 11,37 (-11) 28,39 ± 4,38 (-1) 2,72 ± 0,49 (-11) 8 Интактная + фенибут (%) 79,98 ± 9,04 (-6) 31,45 ± 4,63 (± 11) 2,58 ± 0,22 (-15) 9 Интактная + фенотропил (%) 100,38 ± 9,6“ (± 18) 30,76 ± 7,98 (± 8) 3,41 ± 0,2“ (± 12) “Изменения статистически значимы относительно аналогичных показателей интактной группы (критерий Манна - Уитни, р < 0,05). повышал ДК на 90 % (р < 0,05), салифен - на 86 % (р < 0,05), мефебут- на 48 % (р < 0,05), толибут - на 47 % (р < 0,05), нейроглутам - на 47 % (р < 0,05), фенибут - на 33 % (р < 0,05), соединение РГПУ-238 -на 26 % (р < 0,05), баклофен - на 23 % (р < 0,05) относительно показателей контрольной группы (рис. 3). Изменения статистически значимы относительно аналогичных показателей: “интактной группы (t-критерий Стьюдента, р < 0,05); #контрольной группы (критерий Ньюмена - Кейлса, р < 0,05). Рис. 1. Влияние производных ГАМК и глутаминовой кислоты на скорость стимулированного дыхания (V3 по Чансу) митохондрий клеток печени, инкубированных с ГПТБ Изменения статистически значимы относительно аналогичных показателей: “интактной группы (t-критерий Стьюдента, р < 0,05); #контрольной группы (критерий Ньюмена - Кейлса, р < 0,05). Рис. 2. Влияние производных ГАМК и глутаминовой кислоты на скорость дыхания (V4 по Чансу) митохондрий клеток печени, инкубированных с ГПТБ, после исчерпания добавленной АДФ Изменения статистически значимы относительно аналогичных показателей: “интактной группы (t-критерий Стьюдента, р < 0,05); #контрольной группы (критерий Ньюмена - Кейлса, р < 0,05). Рис. 3. Показатель ДК митохондрий клеток печени, инкубированных с ГПТБ и производными ГАМК и глутаминовой кислоты В настоящее время терапевтические эффекты препаратов, созданных на основе ГАМК и глутаминовой кислоты, объясняют рядом механизмов, а именно -ограничением образования АФК, ингибированием митохондриального пути апоптоза, повышением энергопродукции, изменением транспорта ионов, влиянием на продукцию NO и на активность анти-оксидантных ферментов [9]. На основании данных проведенного нами исследования о влиянии препаратов ГАМК и глутаминовой кислоты на скорость поглощения кислорода митохондриями в различных состояниях по Чансу можем сделать следующие предположения о воздействии изученных препаратов на митохондрии. Фенибут(4-амино-3-фенил-бутановая кислота) оказывал небольшое разобщающее влияние на интактные митохондрии, наиболее выраженное для I комплекса ЦПЭ. При инкубировании с поврежденными митохондриями он увеличивал V3 и, как следствие, показатель ДК по сравнению с таковым контрольной группы. Таким образом, действие фенибута можно связать с ограничением повреждающего действия АФК на структуру дыхательной цепи. Его аналоги мефебут (метиловый эфир фенибута) и толибут (4-амино-3-метилфенил-бутановая кислота) практически не оказывали влияния на интактные митохондрии. Воздействие их на поврежденные митохондрии способствовало увеличению скорости стимулированного дыхания и ДК, что свидетельствует об ограничении повреждающего действия ГПТБ. Еще одно производное фенибута - баклофен (4-амино-3-(парахлорфенил)-бутановая кислота) -оказывал существенное разобщающее действие на интактные митохондрии, при этом инкубация данного препарата с поврежденными митохондриями ограничивала разобщение за счет работы 2-го комплекса дыхательной цепи. Возможно, изучаемый препарат сам вызывает небольшой оксидантный эффект или повреждение 1-го комплекса, в результате вклад 2-го комплекса в передачу электронов увеличивается, что в целом позволяет митохондрии поддерживать нормальную энергопродукцию. Добавление нейроглутама (гидрохлорида бета-фенилглутаминовой кислоты) к интактным митохондриям приводило к небольшому снижению скорости потребления кислорода и ДК, однако инкубирование с поврежденными митохондриями вызывало противоположный эффект. Можно предположить, что нейро-глутам способен перехватывать электроны в дыхательной цепи, что при окислительном повреждении ограничивает их «утечку». Соединение РГПУ-238 JOURNAL ОГ VOLGOGRAD STATE MEDICAL UNIVERSITY (гидрохлорид диметил-3-фенилглутаминовой кислоты) оказывало незначительное влияние на митохондрии in vitro. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Наибольшие значения показателя ДК наблюдались при добавлении салифена (композиция фенибута с салициловой кислотой) и фенотропила ^-карбамоилметил-4-фенил-2-пирролидон) как к интактным, так и к поврежденным митохондриям. Происходило увеличение скорости поглощения кислорода в состоянии V3 и снижение в состоянии V4, что свидетельствует о повышении сопряжения в дыхательной цепи. Таким образом, салифен и фенотропил оказывали выраженное защитное действие на дыхательные комплексы ЦПЭ.

About the authors

Gulnara Kh. Khusainova

Volgograd State Medical University

Postgraduate student of the Department of Theoretical Biochemistry with a course in Clinical Biochemistry Volgograd, Russia

Tamara А. Popova

Volgograd State Medical University

Candidate of Biological Sciences, Associate Professor of the Department of Theoretical Biochemistry with a course in Clinical Biochemistry Volgograd, Russia

Margarita V. Kustova

Volgograd State Medical University

Email: kustova13@gmail.com
Assistant of the Department of Theoretical Biochemistry with a course in Clinical Biochemistry Volgograd, Russia

Oleg V. Ostrovsky

Volgograd State Medical University

Email: ol.ostr@gmail.com
Doctor of Medical Sciences, Professor, Head of the Department of Theoretical Biochemistry with a course in Clinical Biochemistry Volgograd, Russia

References

Supplementary files