SAFETY ASSESSMENT OF KAPPA-OPIOID ANALGETICS - COMPOUNDS RU-1205

Full Text

Агонисты каппа-опиоидных рецепторов являются перспективной мишенью для фармакологической коррекции болевого синдрома [1]. Их применение не сопровождается угнетением дыхания, развитием толерантности, зависимости, эйфории, в отличие от традиционных неселективных агонистов опиоидных рецепторов [1, 2]. К побочным эффектам агонистов каппа-рецепторов можно отнести развитие дисфории, вследствие активации p38a митоген-активируемой протеинкиназы (МАРК киназы) [3]. p38-a МАРК киназа относится к семейству серин/треониновых киназ [4]. Экспрессируется в нейронах прилежащего ядра мезо-кортиколимбической системы, которая задействована в формировании дисфории [3]. Соединение SB203580 ингибирует p38-a МАРК киназу и устраняет аверсивные эффекты агониста каппа-опиоидных рецепторов U50,488 [3]. Таким образом, сочетание селективного агонизма в отношении каппа-опиодных рецепторов и ингибирование p38-a МАРК киназы является перспективным для поиска новых анальгетических средств. Выявлена фармакологическая субстанция (ФС) РУ-1205, имеющая высокую селективность в отношении каппа-опиоидных рецепторов, ингибирующая нейрональную р38-зависимую МАРК-киназу [5]. В ранее проведенных исследованиях по изучению острой токсичности ФС РУ-1205 были рассчитаны показатели ЛД50 (для мышей - 1898,96 мг и 1565,05 мг; для крыс - 1534,25 мг и 1565,05 мг самцов и самок соответственно). Исходя из полученных величин, ФС РУ-1205 относится к 4-му классу токсичности (малоопасному) согласно ГОСТ 12.1.007-76. Для проведения I фазы клинических исследований необходимо опираться на данные о фармакологических и токсикологических свойствах новых соединений [6]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Изучение хронической токсичности каппа-агониста ФС РУ-1205 при пероральном введении. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Фармакологическая субстанция соединения РУ-1205 (дигидрохлорид9-(2-морфолиноэтил)-2-(4-фтор-фенил)имидазо[1,2-а]-бензимидазол) синтезирована в НИИ физической и органической химии Южного федерального университета, г. Ростов-на-Дону [7]. Чистота соединения составляла не менее 99,46 %. Исследования проводились на половозрелых (120 дней) беспородных крысах обоего пола, массой 180-210 г в количестве 200 особей, полученных из питомника лабораторных животных «Рапполово» РАМН (Санкт-Петербург, Россия). Животные до начала эксперимента подверглись карантину в течение 14 дней в виварии. Грызуны имели круглосуточный доступ к кормушкам и поилкам ad libitum и содержались в стандартизированных условиях вивария (постановление от 29.08.2014 № 51 «Об утверждении СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментальнобиологических клиник (вивариев)», директива Европейского парламента и Совета Европейского Союза 2010/63/ЕС от 22 сентября 2010 г. «О защите животных, использующихся для научных целей»). Животных содержали группами по 5 особей, при регулируемом совмещенном световом режиме (12/12 ч) и температуре 20-22 °С. Эксперименты были одобрены региональным исследовательским этическим комитетом Волгоградской области (регистрационный номер IRB 00005839 IORG 0004900 (OHRP), протокол № 2077-2018 от 30 октября 2018 г.). Животные рандомизированно были распределены на 4 группы по 20 особей самцов и самок в каждой: группа интактного контроля (без введения каких-либо веществ); опытная группа № 1, животным вводили соединение РУ-1205 в терапевтической дозе (ТД) 5 мг/кг; опытная группа № 2, животным вводилось соединение РУ-1205 в дозе 50 мг/кг (10 х ТД); опытная группа № 3, животные получали соединение РУ-1205 в дозе 500 мг/кг (100 х ТД). ФС РУ-1205 вводили в течение 3 месяцев, ежедневно, перорально, в первой половине дня, после этого следовал период отмены 30 дней (1 месяц). Еженедельно регистрировали массу тела животных CAS MW-1200 (Южная Корея), а также в автоматическом режиме подсчитывали количество потребляемой воды и пищи. Изучение поведенческой активности проводили по окончании курса введения вещества, а также через 1 месяц после отмены соединения в тесте «открытое поле» согласно методике [8, 9, 10]. При тестировании животных в установке «открытое поле» наблюдения вели в течение 3 мин. За этот период у них фиксировали горизонтальную активность (КПК - количество пересеченных квадратов); вертикальную активность (КПЗЛ - количество подъемов на задние лапы); исследовательскую активность (КЗО - количество заглядываний в напольные отверстия); об эмоциональном состоянии судили по количеству фекальных болюсов (КФБ), а также по количеству актов груминга (КАГ). Показатели периферической крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов) определяли с помощью гематологического анализатора Abacus Junior Vet (Diatron Messtechnik GmbH, Австрия). Подсчет лейкоцитарной формулы проводили в окрашенных по Романовскому - Гимзе мазках крови, используя микроскоп МБИ-3 (ЛОМО, Россия). Скорость оседания эритроцитов (СОЭ) определяли по методу Панчен-кова (мм/ч). Время свертывания крови определяли по методу Мас - Магро. При проведении биохимических исследований определяли содержание глюкозы, мочевины, креа-тинина, общего холестерина, активность щелочной фосфатазы (ЩФ), аланин- и аспартатаминотранфераз (АлАТ, АсАТ), используя наборы Био-Ла-Тест (ERBA Lachema, Чехия) согласно инструкциям для каждого набора. При проведении патоморфологических проводили макроскопическое обследование внутренних органов. Головной мозг, сердце, тимус, легкие, селезенку, печень, почки, надпочечники, эпидидимис, тестикулы, яичники выделяли, взвешивали на торсионных весах типа WT (Techniprot, Польша), готовили из органов гистологические срезы для микроскопичесих исследований (микроскоп бинокулярный Leika DM 750, Германия, окраска гематоксилин-эозин, окуляр 7 и объектив 40). Статистическая обработка проводилась с использованием Microsoft Excel 2010 и Statistica 6.0. Достоверность результатов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В период проведения хронического эксперимента выявлен положительный прирост массы тела животных во всех исследуемых группах. В опытных группах, получавших ФС РУ-1205 в дозе 5 и 50 мг/кг, отличий от групп контроля выявлено не было. Прирост массы тела животных, получавших ФС РУ-1205 в дозе 500 мг/кг, составил 15,6 % у самцов и 7,6 % у самок и был ниже значений группы контроля (24 % в среднем). Также в группе, получавшей максимальную дозу субстанции, было отмечено изменение общего состояния животных (элементы неопрятности шерстного покрова, бледность видимых слизистых и кожных покровов). Через 1 месяц после отмены ФС РУ-1205 были зафиксированы эффекты реабилитации: прирост массы тела в группе животных, получавших соединение в дозе 500 мг/кг, возобновлялся в полном объеме и относительно 3-го месяца испытаний составил в группах самцов и самок 20,9 г и 10,7 г соответственно, против 10,7 г и 4,8 г соответственно в группе контроля. Таблица 1 Влияние ФС РУ-1205 на некоторые показатели периферической крови крыс при пероральном введении (M ± m) Показатели Пол Группа контроля ФС РУ-1205, 5 мг/кг ФС РУ-1205, 50 мг/кг ФС РУ-1205, 500 мг/кг Гемоглобин, г/л самцы 152,8 ± 3,9 129,0 ± 3,4“ 131,3 ± 3,7“ 127,5 ± 3,5“ самки 146,8 ± 1,2 149,0 ± 2,4 151,3 ± 1,2“ 145,0 ± 2,1 Гематокрит, л/л самцы 47,30 ± 1,08 43,10 ± 0,41“ 42,90 ± 1,26“ 33,30 ± 7,76“ самки 41,20 ± 0,68 42,00 ± 0,67 43,20 ± 0,17 41,30 ± 0,44 Цветовой показатель, у.е. самцы 0,50 ± 0,03 0,40 ± 0,01 0,40 ± 0,01 0,40 ± 0,02 самки 0,50 ± 0,02 0,50 ± 0,03 0,50 ± 0,02 0,50 ± 0,02 Палочкоядерные нейтрофилы, % самцы 2,80 ± 0,48 4,50 ± 0,87 2,30 ± 0,95 1,30 ± 0,25“ самки 2,80 ± 0,25 3,30 ± 0,48 2,80 ± 0,63 2,50 ± 0,29 Сегментоядерные нейтрофилы, % самцы 14,50 ± 2,78 18,0 ± 2,8 18,00 ± 2,35 15,5 ± 3,5 самки 14,50 ± 1,32 12,00 ± 2,35 14,00 ± 1,47 19,30 ± 2,06 Моноциты, % самцы 2,30 ± 0,48 4,00 ± 1,08 3,00 ± 0,41 4,80 ± 0,48“ самки 1,80 ± 0,25 2,50 ± 1,19 1,30 ± 0,25 1,80 ± 0,25 “Изменения достоверны относительно интактного контроля при р < 0,05. При изучении влияния ФС РУ-1205 в дозах 5 и 50 мг/кг на пищевую и питьевую активности животных не выявлено существенных различий с группой контроля, в дозе 500 мг/кг ФС РУ-1205 оказывает угнетающее влияние, более выраженное на самок (р < 0,05). Данные изменения были обратимы и восстанавливались в период отмены введения испытуемого вещества. В исследованиях двигательной и поведенческой а ктивности, проведенных на 3-й месяц эксперимента, отмечено отсутствие достоверных изменений в двигательном поведении опытных животных. При этом наблюдается недостоверное снижение в опытных группах, получавших ФС РУ-1205 в дозах 5 и 50 мг/кг вертикальной (на 34,7 и 26,5 % соответственно у самок и на 22 и 52 % - у самцов) и горизонтальной активностей (на 18,1 и 10,7 %,соответственно у самок и на 10,3 и 29,0 % у самцов), при этом эмоциональное поведение (КАГ и КФБ) существенно не изменялось, снижалось лишь КФБ, но не изменялся груминг. У животных, получавших РУ-1205 в дозе 500 мг/кг, горизонтальная подвижность и вертикальные стойки практически соответствовали контрольным значениям, КАГ недостоверно снижалось на 33,3 %, КФБ не изменялось - у самцов, тогда как КАГ достоверно повышалось (р < 0,05) на 73,1 %, и КФБ на 42,3 % (р < 0,05) у самок, через месяц после отмены данные опытных групп соответствовали группе животных, получавших дистиллированную воду. Таким образом, из результатов проведенных исследований можно заключить, что ФС РУ-1205 при 3-месячном пероральном введении крысам оказывает обратимое незначительное депримирующее влияние на все исследуемые формы поведенческой активности. По результатам исследований периферической к р ови крыс, получавших ФС РУ-1205 перорально в течение 3 месяцев, отмеченные изменения находились в пределах физиологических норм (табл. 1). После хронического введения животным ФС РУ-1205 количество эритроцитов, лейкоцитов, лимфоцитов, тромбоцитов, а также время свертываемости крови, скорость оседания эритроцитов не изменялись. При этом количество гемоглобина во всех опытных группах самцов снижалось в среднем на 15 % относительно группы контроля. Вместе с тем в данных группах изменялись относительные расчетные величины: цветовой показатель (статистически незначительно) и гематокрит (наблюдалась тенденция к снижению). Измененные показатели оставались при этом в границах физиологической нормы и восстанавливались через 1 месяц после отмены соединения. В опытных группах самок похожих изменений показателей выявлено не было. В образцах крови опытной группы крыс-самцов, получавших ФС РУ-1205 в дозе 500 мг/кг, отмечались признаки статистически незначимой JOURNAL OF VOLGOGRAD STATE I MEDICAL UNIVERSITY палочкоядерной нейтропении и моноцитоза. Через 1 месяц после отмены введения соединения данные признаки не обнаруживались. Таким образом, из представленных данных можно сделать заключение об отсутствии патологического влияния вещества РУ-1205 в дозах 5, 50 и 500 мг/кг на показатели периферической крови, так как приведенные выше изменения укладывались в рамки физиологической нормы крыс и восстанавливались до уровня контроля в период отмены введения вещества. По результатам проведенных исследований биохимических показателей сыворотки крыс в опытных группах отмечалась тенденция снижения активности щелочной фосфатазы, АсАТ и АлАТ у самцов в опытной группе, получавшей ФС РУ-1205 в дозе 500 мг/кг (табл. 2), однако данные сдвиги не выходили за рамки физиологической нормы. Таблица 2 Биохимические параметры Пол Группа контроль ФС РУ-1205, 5 мг/кг ФС РУ-1205, 50 мг/кг ФС РУ-1205, 500 мг/кг Глюкоза, ммоль/л самцы 5,06 ± 0,31 4,99 ± 0,09 5,28 ± 0,47 5,15 ± 0,20 самки 5,53 ± 0,22 5,27 ± 0,09 5,35 ± 0,26 5,68 ± 0,20 Креатинин, ммоль/л самцы 131,39 ± 2,21 128,98 ± 3,85 129,61 ± 3,49 121,45 ± 2,73* самки 136,41 ± 6,03 159,11 ± 23,61 158,80 ± 5,03* 126,79 ± 1,78 Щелочная фосфатаза, мккат/л самцы 5,88 ± 0,33 4,34 ± 0,31* 6,20 ± 0,68 4,97 ± 1,12 самки 2,86 ± 0,30 2,83 ± 0,08 3,91 ± 0,74 3,03 ± 0,20 АлАТ, мккат/л самцы 0,42 ± 0,03 0,44 ± 0,04 0,43 ± 0,02 0,37 ± 0,04 самки 0,45 ± 0,02 0,35 ± 0,02* 0,44 ± 0,04 0,33 ± 0,03* АсАТ, мккат/л самцы 1,25 ± 0,04 1,10 ± 0,03* 1,06 ± 0,02* 0,98 ± 0,01* самки 1,14 ± 0,03 1,02 ± 0,06 1,11 ± 0,06 0,90 ± 0,03* Холестерин, ммоль/л самцы 2,67 ± 0,33 2,05 ± 0,07 2,52 ± 0,17 2,05 ± 0,09 самки 2,19 ± 0,12 2,64 ± 0,28 2,74 ± 0,32 3,44 ± 0,16* "Изменения достоверны относительно интактного контроля при p < 0,05. Влияние ФС РУ-1205 на биохимические показатели сыворотки крови крыс при пероральном введении (М ± м) В исследованиях, проведенных после отмены введения крысам ФС РУ-1205, каких-либо различий в содержании основных биохимических параметров плазмы крови опытных и контрольных животных не обнаружено, что может свидетельствовать об отсутствии патологического воздействия вещества на основные виды обмена в дозах, существенно превышающих 5 мг/кг. При макроскопической оценке внутренних органов (головной мозг, сердце, тимус, легкие, селезенка, почки, надпочечники, эпидидимис, тестикулы, яичники), слизистых (ЖКТ), непосредственно контактирующих с вводимой субстанцией РУ-1205 во всех опытных дозах в течение 3 месяцев, видимых изменений не наблюдалось. У опытных групп животных, получавших ФС РУ-1205 в дозах 50 и 500 мг/кг, масса печени была увеличена по сравнению с контрольной группой, края органа сглажены. При микроскопической оценке препаратов печени обнаружены явления мелкозернистой дистрофии гепатоцитов с лизисом ядер и клеточных мембран отдельных клеток. У 2 самок из опытной группы, получавших ФС РУ-1205 в дозе 500 мг/кг, наблюдалась слабовыраженная инфильтрация портальных трактов без нарушения пограничной пластинки и холе-стаз. В исследованиях через 1 месяц после отмены введения соединения на срезах органа только у животных 3-й опытной группы прослеживались зернистая дистрофия гепатоцитов и признаки пролиферации, а также у одной самки наблюдалось выраженное полнокровие сосудов и кариолизис. В тканях головного мозга опытных групп животных, получавших ФС дозах, превосходивших минимально изученную в 10 и 100 раз, прослежива-лись дистрофические изменения отдельных клеток. Через 1 месяц после отмены соединения изменения сохранялись только в группе, получавшей ФС РУ-1205 в дозе 500 мг/кг. Дистрофические изменения наблюдались также на срезах сердца, почек и селезенки в опытной группе, получавшей ФС РУ-1205 в дозе 500 мг/кг, но через 1 месяц после отмены соединения отечности ткани, полнокровия сосудов и дистрофических изменений не прослеживалось. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Соединение РУ-1205 в виде фармакологической субстанции (ФС) в дозах 5, 50 и 500 мг/кг при введении в течение 3 месяцев не оказывало клинически значимых влияний на показатели интегрального состояния животных (динамика массы тела, потребление воды и пищи, общее состояние животных), а также на гематологические и биохимические параметры крови. По результатам теста «открытое поле» можно заключить, что ФС РУ-1205 в дозах 50 и 500 мг/кг при 3-месячном пероральном введении крысам оказывает обратимое незначительное депримирую-щее влияние на все исследуемые формы поведенческой активности. При оценке микропрепаратов сердца, почек и селезенки выявлены обратимые, а в головном мозге и печени - изменения с наличием восстановительных процессов под воздействием ФС РУ-1205 в дозе 500 мг/кг.

About the authors

Lyubov I. Bugaeva

Scientific Center of Innovative Medicines with Pilot Production

Email: li_bugaeva@mail.ru
Volgograd, Russia

Svetlana A. Lebedeva

Scientific Center of Innovative Medicines with Pilot Production

Email: lebedeva.farm@mail.ru
Volgograd, Russia

Elena A. Kuzubova

Scientific Center of Innovative Medicines with Pilot Production

Volgograd, Russia

Tatiana D. Denisova

Scientific Center of Innovative Medicines with Pilot Production

Email: tanyaddenisova@mail.ru
Volgograd, Russia

Yulia V. Lifanova

Volgograd State Medical University

Email: j_semenova_pharm@mail.ru
Volgograd, Russia

Natalia V. Eliseeva

Volgograd State Medical University

Email: nvkirillova@rambler.ru
Volgograd, Russia

Olesya Yu. Grechko

Volgograd State Medical University

Email: olesiagrechko@mail.ru
Volgograd, Russia

Alexander A. Spasov

Volgograd State Medical University; Scientific Center of Innovative Medicines with Pilot Production

Email: aspasov@mail.ru
Volgograd, Russia

References

Supplementary files