EXPRESSION OF CD31 PROTEINS, WILLEBRAND FACTOR AT DIFFERENT TIMES OF COVID-19 PNEUMONIA

Full Text

В настоящее время современный мир столкнулся с серьезной эпидемиологической угрозой, объявленной пандемией Всемирной организацией здравоохранения в марте 2020 г. Вирус, относящийся к семейству бета-коронавирусов, РНК-содержащий, был назван SARS-CoV-2 инфекцией, а заболевание, им вызываемое - COVID-19 [1, 2]. Весьма стремительное распространение в мире, необычные клинические «маски» и течение заболевания, мутация возбудителя, его тропизм к определенным рецепторам системы ренин-ангиотензин-альдостерон (РААС) c последующим встраиванием генома вируса в клетку-хозяина (легкие, кровеносные сосуды, сердце и прочее) диктуют необходимость тщательного изучения патогенеза COVID-19. Несмотря на то, что в настоящее время при COVID-19 описаны различные эффекты действия вируса SARS-CoV-2 - цитопатический, оксидативный стресс с образованием свободных радикалов, активация макрофагальной системы с развитием цитоки-нового шторма, иммунологическая дисрегуляция -все эти патологические изменения требуют своей патологоанатомической характеристики в разные сроки развития заболевания [3, 4, 5]. Результаты отдельных патологоанатомических исследований свидетельствуют об особенностях поражений кровеносных сосудов легких в разные сроки COVID-19 пневмонии [3, 5]. Принимая во внимание тот факт, что вирус SARS-CoV-2 может повреждать эндотелиальные клетки кровеносных сосудов, следует изучить роль маркеров эндотелиальной дисфункции CD31, фактора Виллебранда (vWF) в разные сроки развития COVID-19 пневмонии. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Оценить экспрессию белков CD31, фактора Виллебранда (vWF) в разные сроки летальных исходов COVID-19 пневмонии. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Материал для выполнения морфологического и иммуногистохимического исследования был получен во время выполнения вскрытий 80 умерших в разных стационарах города Ростова-на-Дону. Во время аутопсий оценивали размеры легких, состояние кровенаполнения, состояние поверхности, вид на разрезе, наличие включений и патологических изменений легочной ткани, в том числе состояние просветов кровеносных сосудов, наличие или отсутствие в них тромбов, посмертных кровяных свертков. При вскрытии сердца обращали внимание на размеры, состояние полостей, наличие или отсутствие тромбов или посмертных кровяных свертков, наличие или отсутствие патологических изменений в клапанном аппарате (эндокардит, пороки, тромботические наложения). Вскрытие легких проводилось по традиционной схеме, с верхних дыхательных путей до нижних дыхательных путей и легочной паренхимы. Наиболее измененные участки легочной ткани (плотные, лаковые, отечные, резко полнокровные) иссекались в виде кусочков размерами не менее 2 * 2 см, отдельно забирался материал для выполнения посмертного ПЦР-исследования с последующим обнаружением вируса SARS-CoV-2. Среди умерших было 42 мужчины, 38 женщин, средний возраст которых составил 69 лет. Анализ историй болезни умерших пациентов с COVID-19 позволил выявить наличие коморбидной патологии: сахарный диабет (32,2 %), артериальная гипертензия (86,4 %), ожирение (33,4 %). Во всех изученных наблюдениях в клиническом и патологоанатомическом диагнозах COVID-19 был выставлен в качестве основного заболевания. С учетом клинической картины основного заболевания, COVID-19, времени появления первых симптомов заболевания, мы разделили умерших пациентов на следующие хронологические группы: 1) 0-14 сут.; 2) 15-21 сут.; 3) 22-40 сут. Для определения степени поражений сосудов легких мы разработали и использовали шкалу полуколичественной оценки признака на основании подсчета пораженных сосудов легких в 10 полях зрения, выраженное в процентах: отсутствие признака (0 %), слабый признак + (1-25 %), умеренный признак ++ (26-50 %), выраженный признак +++ (51-75 %), резковыраженный признак ++++ (76-100 %). Метод полуколичественной оценки морфологических признаков был дополнен исследованием с помощью компьютерной программы ImageJ (US National Institutes of Health, США) морфометрии и фотографии препаратов с увеличением объектива *20 или *40 [6]. Во всех случаях проводили измерение общей площади биоптата и статистического анализа. Микроскопия и фотографирование полученных гистологических препаратов осуществлялись с помощью микроскопа Leica 1000DM c пакетом программного обеспечения (Германия). Статистическую обработку полученных результатов осуществляли на персональном компьютере с применением статистических инструментов программы MedCaLc Statistical Software version 19.1.3. Значения всех выборок подвергли проверке на характер распределения с помощью W-критерия Шапиро -Уилка. Нулевую гипотезу отвергали при пороговом значении p < 0,05. Иммуногистохимическое исследование сосудов легких при COVID-19 пневмонии проводилось с использованием антител к CD31, фактору Виллебранда (vWF) (табл.). Непосредственной причиной смерти больных при COVID-19 были острый респираторный дистресссиндром (45 %), тромбоз ветвей легочной артерии (30 %), полиорганная недостаточность (25 %). Таблица антител Название антитела Прозводитель (фирма) Клон Происхождение антитела Разведение CD31 Cell Marque клон JC70 mouse moclonal antibody rtu Фактор Виллебранда Cell Marque factor VIII-R Ag rabbit polyclonal antibody rtu РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Среди патологических признаков поражений сосудов легких были выделены стаз эритроцитов, альтерация эндотелиоцитов, тромбоз, нейтрофильная инфильтрация стенок сосудов, фибриноидные изменения, гиперплазия эндотелия, регенерация эндотелия. Особое внимание было обращено на наличие или отсутствие воспалительной реакции стенок сосудов при COVID-19, а также степень выраженности клеточной реакции в паренхиме легких. Морфологическими особенностями поражения сосудов легких при COVID-19 пневмонии в течение 14 дней от начала заболевания были полнокровие капилляров межальвеолярных перегородок, резкая эктазия мелких и средних ветвей легочной артерии с началом формирования фибриновых тромбов, на фоне внутриальвеолярного отека с умеренной нейтрофильной инфильтрацией (рис. 1). В эти сроки в стенках сосудов микроциркуляторного русла, мелких артериях была выражена экспрессия белков CD31, фактора Виллебранда (рис. 2, 3). Рис. 1. Резкая эктазия просвета легочной артерии среднего калибра с началом формирования фибринового тромба. Окраска гематоксилином-эозином. Увеличение х100 Рис. 2. Яркая экспрессия белка CD31+ в клетках эндотелия сосудов микроциркуляторного русла легких при COVID-19. Иммуногистохимическая реакция к CD31. Увеличение *200 Рис. 3. Гиперэкспрессия фактора Виллебранда в стенках кровеносных сосудов легких при COVID-19. Иммуногистохимическое исследование с антителами к vWF. Увеличение *200 Спустя 15-21 сут. от начала COVID-19 пневмонии в сосудах мелкого и среднего калибра легких наблюдались пристеночные и обтурирующие смешанные тромбы без признаков организации с умеренной нейтрофильной инфильтрацией стенок (рис. 4). Экспрессия белков CD31 и фактора Виллебранда отличались в разных сосудах легких. Дискретная экспрессия белков в клетках эндотелия была выражена в мелких и средних ветвях легочной артерии, в то же время в эндотелиальных клетках сосудов микроциркуля-яркая линейная экспрессия была хорошо выражена торного русла (рис. 5). Рис. 4. В просветах средних ветвей легочной артерии - обтурирующие смешанные тромбы без признаков организации. Окраска гематоксилином-эозином. Увеличение х100 Рис. 5. Дискретная экспрессия белка CD31+ в отдельных клетках эндотелия средней ветви легочной артерии. Яркая линейная экспрессия белка CD31+ в эндотелиальных клетках сосудов микроциркуляторного русла легких. Иммуногистохимическая реакция к CD31. Увеличение х100 Интересными были морфоиммуногистохимические изменения в легких при COVID-19 пневмонии спустя 22-40 дней после начала заболевания. В просветах артерий мелкого и среднего калибра легких имелись обтурирующие смешанные тромбы с началом организации, при этом отмечалась очаговая гиперплазия клеток эндотелия с формированием «подушкообразного утолщения» интимы и их сужением (рис. 6). Обращало внимание наличие крупных участков ангиоматоза легочной ткани при COVID-19 за счет экспрессии в них белка CD31 (рис. 7). Рис. 6. Обтурирующий смешанный тромб в просвете средней ветви легочной артерии с началом организации. Очаговая гиперплазия клеток эндотелия с формированием «подушкообразного утолщения» интимы и сужением просвета артерии. Окраска гематоксилином-эозином. Увеличение х100 Рис. 7. Умеренно выраженный ангиоматоз за счет мелких новообразованных сосудов CD31+ легких. Иммуногистохимическая реакция с антителом CD31. Увеличение х100 На основании сравнительного морфологического, иммуногистохимического исследований при COVID-19 пневмонии нами были показаны особенности поражения сосудов и паренхимы легких. Так, в течение первых двух недель заболевания преобладали острые циркуляторные расстройства в виде стаза, резкого полнокровия сосудов микроциркуляторного русла с формированием фибриновых тромбов, с яркой экспрессией фактора Виллебранда, CD31. Позднее, в сроки 15-21 дней после начала COVID-19 пневмонии были наиболее выражены деструктивные изменения артерий мелкого и среднего калибра легочной артерии, что сопровождается нарушением свертываемости крови. Морфологи -ческие изменения в стенках сосудов в эти сроки характеризовались развитием плазматического пропитывания, фибриноидного набухания и некроза, микротромбообразованием (фибриновые, смешанные тромбы). Было показано, что уже на 3-й неделе заболевания и позднее спустя 22-40 дней в легких отмечались явления перестройки - ремоделирования в виде гиперплазии эндотелиоцитов стенок мелких артерий, перекалибровки просветов, ангиоматоз стромы. Эти изменения сопровождались выраженной экспрессией белков CD31, vWF, которые являются маркерами клеток эндотелия и могут указывать на их дисфункцию. Результаты компьютерной морфометрии и статистической обработки экспрессии CD31, vWF представлены на рис. 8. Рис. 8. Экспрессия белков CD31, vWF в разные сроки COVID-19 пневмонии. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Научной предпосылкой выполнения данного исследования было представление о роли вируса SARS-CoV-2 в генезе сосудистой патологии легких при COVID-19 пневмонии. Учитывая, что патологоанатомических исследований, посвященных данной проблеме, в современной отечественной и зарубежной литературе представлено немного, мы решили изучить роль белков эндотелия CD31, фактора Виллебранда (vWF) в разные сроки COVID-19 пневмонии. Нами было установлено, что наиболее выраженные васкулярные изменения с развитием микротромбообразования наблюдаются на 2-3-й неделе заболевания, что сопровождается яркой экспрессией белка CD31, умеренной экспрессией белка фактора Виллебранда. Вероятно, изменение экспрессии данных маркеров отражает повреждение клеток эндотелия с тромбообразованием сосудов мелкого и среднего калибра легких. В дальнейшем, через 22-40 дней COVID-19, сохраняются высокие показатели экспрессии CD31+ клеток эндотелия сосудов, что объясняется процессами неоангиогенеза и ремоделирования васкулярного компонента легких. Эти данные дополняют наше представление о патогенезе заболевания в разные его сроки развития, дают представление о морфологических и иммуногистохимических особенностях поражения сосудов различного калибра легких при COVID-19 пневмонии [7, 8, 9, 10].

About the authors

S. S Todorov

Rostov State Medical University

Email: sertodorov@gmail.com
MD, Professor of the Department, Acting Head of the Department of Pathological Anatomy, Head of the Morphological Department, Pathologist of the highest qualification category Rostov-on-Don, Russia

S. S Todorov

Rostov State Medical University

Email: todorov-oo@inbox.ru
5th year student of the Faculty of Medical Prevention Rostov-on-Don, Russia

A. S Kazmin

Rostov State Medical University

Email: kazmin_as@mail.ru
Assistant of the Department of Pathological Anatomy, Pathologist of the highest qualification category Rostov-on-Don, Russia

References

Supplementary files