3 -ARILIDENE-2-OXYNDOLE DERIVATIVES AS MELATONIN ANALOGUES WITH ANTIOXIDANT AND INTRAOCULAR PRESSURE LOWERING PROPERTIES

Full Text

Глаукома является прогрессирующей оптической нейропатией и ведущей причиной необратимой слепоты. Заболевание обычно характеризуется повышенным внутриглазным давлением (ВГД). ВГД в настоящее время является единственным модифицируемым фактором риска, который чаще всего лечится местными офтальмогипотензивными препаратами [1]. Нейрогормон мелатонин, производное индола, вырабатывается не только шишковидной железой, но и несколькими структурами глаза - в частности в сетчатке, радужной оболочке, цилиарном теле, хрусталике и слезных железах [2]. Обобщение литературных данных, полученных в проведенных ранее исследованиях на разных живых организмах (птицы, кролики, крысы, человек), позволило предположить следующее распределение мелатониновых рецепторов в структуре глаза: в роговице встречаются все три вида рецепторов; в хрусталике MT2 и MT3; в цилиарном теле MT2; в склере MT1 и MT2; в сосудистой оболочке MT1; в сетчатке расположены все три вида рецепторов, их соотношение зависит от слоя сетчатки [3]. Одной из физиологических ролей мелатонина является снижение внутриглазного давления (ВГД), что предположительно реализуется через взаимодействие с мелатониновыми рецепторами 1 -го типа в цилиарном теле. Однако в одном из исследований высказано предположение, что рецептор МТ3 является цитозольным ферментом (хинонредуктазой 2) [4]. В отличие от MT1 и MT2, MT3 не связывается с G-белками, имеет 95%-ю гомологию с человеческой хинонредуктазой 2 - цитозольным ферментом, который катализирует восстановление хинонов, таких как менадион и кофермент Q. В настоящее время накоплено большое количество доказательств участия оксидативного стресса в развитии многих глазных заболеваний, включая катаракту, глаукому, возрастную макулярную дегенерацию (ВМД) и диабетическую ретинопатию. Известно, что мелатонин ингибирует NRH:хинон оксидоредуктазу 2 (NQO2), проявляя антиоксидантную активность [5]. Также мелатонин обладает собственной выраженной антирадикальной и противовоспалительной активностью, может активировать цитопротекторные ферменты, способен поддерживать оптимальный мембранный потенциал митохондрий, сохранять митохондриальные функции и улучшать митохондриальный биогенез, чем ослабляет или противодействует окислительному стрессу и регулирует клеточный метаболизм [6]. Все это делает его перспективным средством для лечения заболеваний глаза, связанных с повышенным внутриглазным давлением и оксидатив-ным стрессом. Недостатком мелатонина как офтальмологического лекарственного средства является его низкая стабильность и непродолжительность действия, а также слишком широкий спектр биологической активности. В настоящее время поиск структурных аналогов мелатонина является предметом активных исследований, к о т орые, тем не менее, часто касаются соединений с низким структурным разнообразием, сохраняя метокси- и амидную группу, присутствующие в молекуле мелатонина. В настоящей работе мы исследовали 3-арилиден производные 2-оксиндола в качестве изостеров мелатонина для определения их влияния на активность N0O2, антирадикальных свойств и способности снижать внутриглазное давление. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Поиск новых, более эффективных антиглаукомных средств - ингибиторов хиноноксидоредуктазы 2 (NQO2), определение антиоксидантной активности и изучение влияния активных соединений на внутриглазное давление. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. Исследуемые соединения были синтезированы на кафедре медицинской химии и тонкого органического синтеза ФГБОУ ВО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», как описано ранее [7]. Животные. Все процедуры с животными в исследовании проводились в соответствии с общепринятыми этическими нормами манипуляций с животными. Содержание животных соответствовало правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 351.000.3-96 и 51000.4-96), Приказу МЗ и СР РФ от 23 августа 2010 г. № 708н «Об утверждении Правил лабораторной практики», а также отвечали директивам 2010/63/EU Европейского Парламента и Совета Европейского Союза от 22.09.2010 г по охране животных, используемых в научных целях. Проведение экспериментов одобрено Комиссией по биомедицинской этике ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» IRB 00005839 IORG 0004900, OHRP, Свидетельство № 2021/056 от 15.06.2021. Животные содержались в условиях вивария ФГБОУ ВО ВолгГМУ Минздрава России при температуре 24 °С и относительной влажности 60 % при естественном световом цикле со свободным доступом к корму и воде. Определение активности N0O2. Изучение ингибирующей активности соединений в отношении рекомбинантной NOO2 человека (Sigma #00380, США) оценивали кинетическим методом с использованием менадиона и N-бензил-дигидроникотинамида (BNAH) в качестве субстрата и ко-субстрата соответственно. Все реагенты и тестируемые вещества разводили в 50 мМ Hepes-KOH, pH 7.4, с добавлением 1 мМ р-октил-Э-глюкопиранозид, 0,1 мг/мл БСА и 1 мкМ ФАД. В 96-луночный планшет с плоским дном вносили 50 мкл исследуемых веществ в конечной концентрации 10 мкМ для первичного скрининга, а для изучения концентрационной зависимости веществ использовали диапазон конечных концентраций от 10 нМ до 100 мкМ. В качестве препарата сравнения использовали квер-цитин. Вещества преинкубировали 5 минут с 50 мкл человеческой рекомбинантной NOO2 (конечная концентрация 42 нг/мл). После вносили 25 мкл менадиона в конечной концентрации 100 мкМ. Реакцию запускали 25 мкл 100 мкМ BNAH. Измерения проводят по убыванию флуоресценции ко-субстрата BNAH при длине волны возбуждения 370 нм и длине волны испускания 440 нм в условиях постоянной температуры 37 °С. Связывание гидроксильного радикала. Связывание ОН^- радикала изучали по снижению люминесценции в реакционной среде, содержащей гемоглобин, люминол и перекись водорода. Для разведения всех реактивов использовали 50 мМ PBS (pH 7,4). В белый 96-луночный планшет вносили 25 мкл 0,2 мг/мл раствора гемоглобина, 100 мкл 100 мкМ ЭДТА, 25 мкл исследуемого вещества. Для первичного скрининга конечная концентрация исследуемых веществ составляла 100 мкМ, для концентрационного исследования использовался диапазон конечных концентраций от 64 нМ до 1 мМ, конечная концентрация ДМСО не превышала 2 %. В качестве препарата сравнения использовался Тролокс. После вносили 50 мкл раствора люминола (конечная концентрация 1 мкМ), соблюдая непопадание прямого света на реагент. Реакцию запускали 50 мкл 0,025%-го раствора H2O2 и тут же переносили планшет в микропланшетный ридер Infinite M200 PRO (Tecan, Австрия) для регистрации люминесценции в течение 30 минут с интервалом в 20 сек. Расчет ингибирования свободнорадикального процесса производили по величине площадей под кривыми сигнал-время. Связывание радикала ДФПГ. Связывание DPP^-радикала определяли по изменению оптической плотности спиртового раствора 2,2-дифенил-1-пикрил-гидразила (ДФПГ, DPPH). Конечная концентрация веществ составляла 100 мкМ. Все реактивы и исследуемые соединения растворяли в 95%-м этиловом спирте. В микропланшет вносили 200 мкл 0,5 мМ раствора ДФПГ, 20 мкл исследуемого вещества или этилового спирта. В качестве препаратов-сравнения использовали тролокс и кверцетин. Для определения активности соединений измеряли оптическую плот-н ость полученной смеси спектрофотометрически п р и Amax 517 нм в микропланшетном ридере Infinite M200 PRO (Tecan, Австрия) через 24 ч. Для предотвращения испарения спиртовых растворов, на время между определениями, микропланшет заклеивался специальной пленкой. Связывание радикала АБТС. Связывание радикала ABTS^- определяли по изменению оптической плотности спиртового раствора 2,2'-азино-бис(3-этилбензо-тиазол-6-сульфоновой кислоты (АБТС, ABTS). Генерацию радикала обеспечивает добавление в реакционную среду системы пероксид водорода (конечная 96 = Т. 19, №4.2022 концентрация 0,025 %) - гемоглобин (1 мг/мл) реактива АБТС (конечная концентрация 150 мкМ). В микропланшет добавляли 50 мкл раствора ABTS*, 50 мкл этилового спирта и 50 мкл раствора исследуемых веществ или препаратов сравнения. Для скрининга использовалась концентрация 100 мкМ, после выявления соединений-лидеров проводилось исследование в диапазоне концентраций от 25,6 нМ до 1 мМ. Концентрацию ABTS* определяли спектрофотометрически при длине волны 734 нм с использованием микропланшетного ридера Tecan Infinite M200 PRO (Tecan, Австрия). Определение цитотоксичности. Оценку цитотоксичности наиболее активных соединений проводили с помощью МТТ-теста [8] на клетках эпителиальных линий МСР-7 (аденокарцинома протоков молочной железы человека, ATCC® HTB-22™) и HepG2 (гепато-целлюлярная карцинома человека, ATCC® HB-8065™). Культивацию проводили в ростовой среде DMEM (Gibco, США) с добавлением 1%-го раствора незаменимых аминокислот (Sigma-ALdrich, США), раствора пирувата натрия 2 мМ (Sigma-ALdrich, США) для MCF-7 либо ростовой среде F-12 (ПанЭко, Россия), содержащей 0,002М L-глутамина (ПанЭко, Россия) для HepG2, с добавлением 10%-й эмбриональной телячьей сыворотки (ПанЭко, Россия), 1%-го пенициллина-стрептомицина (Gib^, США), в СО2-инкубаторе при температуре 37 °С в атмосфере 5 % СО2. Вещества исследовали в диапазоне концентраций от 0,01-100 мкМ с инкубацией в течение 48 ч. Жизнеспособность клеток, коррелирующую со способностью митоходриальных дегидрогеназ превращать МТТ-реагент (бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия) в фор-мазан, определяли по данным оптической плотности при 555 нм (референсная длина волны 650 нм) с использованием планшетного ридера CLARIOstar (BMG LabTech, США). Обработку данных и расчет СС50 (концентрация, подавляющая жизнедеятельность клеток на 50 % относительно интактного контроля) проводили с помощью программного обеспечения MARS Data Analysis Software и GraphPad Prism v.7.0. Определение внутриглазного давления у крыс. Изучение влияния производных 3-арилиден-2-оксиндола на внутриглазное давление проводили на лабораторных животных - беспородных крысах обоего пола (питомник «Рапполово», Ленинградская обл.) методом тонометрии по методике с помощью контактного ветеринарного тонометра Tonovet iCare (Финляндия), позволяющего осуществлять измерение без использования поверхностной анестезии роговицы. Всем животным в правый (тестируемый) глаз закапывали 0,4%-е растворы исследуемых веществ или препарата сравнения в объеме 50 мкл, в левый (контрольный) глаз инсталлировали деионизированную воду в том же объеме. Внутриглазное давление измеряли в обоих глазах в течение четырех часов каждый час. Левый глаз, в свою очередь, служил для оценки возможного резорбтивного действия исследуемых соединений. Расчет молекулярных свойств. Для каждого соединения выполнен расчет характеристик, относящихся к лекарственному подобию, включая молекулярный вес M, показатель липофильности cLogP, количество доноров и акцепторов водородных связей Hoonors и HAcceptors, количество атомов галогенов ^Halogens, количество тяжелых атомов NHeavy, площадь полярной поверхности PSA. Все описанные расчеты выполнены с помощью программы OSIRIS DartaWarrior (Idorsia, Inc.). Расчет проницаемости роговицы для соединений. Расчет показателя проницаемости роговицы глаза для соединений LogPapp выполнен в соответствии с двумя ранее опубликованными OSAR -моделям [9, 10] по уравнениям: LogPappi = -4,002 - 0,169 * (HAcceptors + Hoonors) + 0,265 х LogP LogPapp2 = -4,6823 - 0,767 * Log(PSA) - 0,1346 * Hoonors + + 3,0024 * NHalogens/NHeavy Статистическая обработка. Статистическую обработку проводили в Prism 8.0 (GraphPad Inc.) с расчетом среднего арифметического и стандартного отклонения. При сравнении групп использовали непараметрический критерий Манна - Уитни. Величины полуэффективных концентраций определяли с помощью нелинейной 3-параметрической регрессии. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Производные 3-арилиден-2-оксиндола были синтезированы и исследованы как структурные аналоги мелатонина. Из 8 исследованных на ингибирующую активность NQO2, 6 соединений по величине IC50 существенно превосходили активность мелатонина. Возможно, это связано с большим сродством данных соединений к ФАД-ассоциированному центру связывания за счет плоской п-сопряженной системы. Соединения 1, 2 и 8 показали максимальное ингибирование, общим в их структуре является наличие электронодонорных заместителей в 3-фенилиденовом фрагменте. Соединения 4 и 6 оказались лишены активности. По способности связывать супероксид-анион соединения 1-4 были наиболее активными, превосходя мелатонин. Производные 5 и 6 уступали ему, а 7 и 8 не проявили антирадикальную активность. Выявлено, что наибольшей NQO2-ингибирующей активностью и антирадикальным действием обладают соединения, содержащие электронодонорные заместители в 3-арилиденовом фрагменте. Стери-ческие особенности мало влияли на антиоксидантную активность. Для предварительной оценки фармакокинетических свойств соединений был выполнен расчет их основных физико-химических свойств. Полученные значения были использованы для определения расчетной проницаемости соединений через покровы глаза с использованием ранее опубликованных OSAR-моделей. Показано, что согласно прогнозу, исследуемые соединения обладают способностью преодолевать роговицу сопоставимо с мелатонином. Соединения 6 и 7 превосходили мелатонин по этому показателю согласно обеим моделям (табл. 1, 2, рис. 1-3). Рис. 1. Химическая структура мелатонина и исследуемых веществ 1-8, его структурных аналогов Таблица 1 Биологическая активность исследованных соединений in vitro Соединение R1 R2 X NQO2 ИК50 ± SE, мкМ 1 CH3OCONH OH CH 0,40 ± 0,06 2 Фурил-CONH OH CH 0,43 ± 0,02 3 Фенил-CONH OH CH 3,99 ± 0,36 4 NO2 H N >100 5 CH3OCONH NO2 CH 1,51 ± 0,29 6 H H N >100 7 - - - 0,87 ± 0,20 8 CH3CONH 3,4,5-(CH3O)3 CH 0,45 ± 0,06 Мелатонин - - - 63,5 ± 26,7 Кверцетин - - - 0,08 ± 0,02 Тролокс - - - - "Статистическая значимость к контролю (Манна - Уитни), p > 0,05. Антиоксидантная активность исследованных соединений in vitro Таблица 2 Соединение Связывание ОН , ИК50 ± SE, мкМ Связывание DPP^ , m ± SD, 100 мкМ, % С в язывание ABTS^ %, m ± SD, 100 мкМ, % (ИК50 ± SE, мкМ) 1 6,1 ± 1,6 16,96 ± 0,90* 89,79 ± 0,63* (18,16 ± 3,95) 2 6,47 ± 1,50 2,51 ± 3,21 79,04 ± 3,23* (35,99 ± 3,45) 3 8,61 ± 1,80 3,62 ± 0,73 85,80 ± 2,65* (104,9 ± 2,12) 4 8,49 ± 2,30 19,27 ± 5,55 49,40 ± 3,43* (>100) 5 57,8 ± 5,5 -4,81 ± 1,16 -4,54 ± 3,79 6 67,4 ± 12,8 -0,41 ± 0,87 4,49 ± 0,63 7 >100 1,78 ± 2,56 5,35 ± 7,83 8 >100 -1,40 ± 0,63 35,10 ± 7,91 Мелатонин 21,3 ± 2,8 3,16 ± 0,89 98,76 ± 3,01* (4,56 ± 0,76) Кверцетин 0,302 ± 0,019 79,62 ± 0,64* 61,45 ± 0,90“ (79,57 ± 4,36) Тролокс 5,75 ± 0,41 90,45 ± 0,13* 102,10 ± 2,48* (37,80 ± 11,38) “Статистическая значимость к контролю (Манна - Уитни), p < 0,05. вестник ВОЛГОГРАДСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО МЕДИЦИНСКОГО УНИВЕРСИТЕТА Рис. 2. Связывание ОН тролоксом и соединением 1 в зависимости от конечной концентрации, % - Тролокс - Соед.1 C, мкМ Т ролокс Соед.1 Рис. 3. Связывание ABTS^- тролоксом и соединением 1 в зависимости от конечной концентрации, % Таким образом, в результате в качестве соединения-лидера было выбрано соединение 1, которое сочетает ингибирующую N0O2 человека активность (ИК50 0,4 мкМ) с антирадикальной активностью (ИК50 по связыванию супероксид-аниона 6,1 мкМ), превосходя мелатонин по обоим показателям (табл. 3). Учитывая предполагаемое местное применение (инстилляция в глаза), для наиболее перспективного соединения 1 предварительно была оценена цитотоксичность на стабильных линиях клеток (МС F-7, HepG2). Показано, что величина средней цито-токсической концентрации превышает величину 100 мкМ как для соединения 1 (R2 = 0,9), так и для мелатонина (R2 = 0,9) после 48 часовой инкубации в МТТ-тесте, что соответствует веществам с низкой цитотоксичностью. Далее, соединение 1 было исследовано in vivo на наличие офтальмогипотензивного действия. При местном применении 0,4%-го раствора соединение 1 приводило к снижению ВГД опытных крыс на (40,9 ± 6,4) %, не оказывая значимого влияния на величину ВГД коллатерального глаза, что позволяет предположить отсутствие системного гипотензивного действия. Инстилляция 0,4%-го раствора мелатонина приводила к максимальному снижению ВГД на (28,0 ± 11,3) % (рис. 4). Для обоих соединений развитие максимального офтальмогипотензивного эффекта наступало через 3 часа после применения. Показано, что среди мелатониновых биоизо-стеров - производных 3-арилиден-2-оксиндола наибольшей NQO2-ингибирующей активностью обладают соединения, содержащие электронодонорные за м естители в 3-арилиденовом фрагменте (1, 2, 7, 8). Наиболее активное соединение 1 ингибирует NQO2 человека с ИК50 0,4 мкМ и проявляет антирадикальную активность, связывая супероксид-анион с ИК50 6,1 мкМ, превосходя мелатонин по обоим показателям (21,3 мкМ). Таблица 3 Расчетные физико-химические характеристики соединений Соединение cLogP H-Акцепторы H-Доноры Площадь полярной поверхности LogPapp2 LogPappi Мелатонин 1,47 4 2 54,12 -6,28 -4,63 1 1,83 6 3 87,66 -6,58 -5,04 2 2,26 6 3 91,57 -6,59 -4,93 3 3,07 5 3 78,43 -6,54 -4,54 4 0,53 6 1 88,06 -6,31 -5,04 5 1,25 8 2 113,25 -6,53 -5,36 6 1,32 3 1 41,99 -6,06 -4,33 7 2,05 3 1 46,17 -6,09 -4,14 8 1,76 7 2 85,89 -6,43 -5,06 Интактная группа CD 140п 120- 100- 80 60- 40 20 0 0 о Контрольный глаз 60 120 180 240 300 Время, мин Тестовый глаз Соед. 1, 0,4% р-р Мелатонин, 0,4% р-р Время, мин ш 140п 120- 100- 80 60- 40 20 0 о Контрольный глаз □ Тестовый глаз "... .....„.г., ■и--- 0 60 120 180 240 300 Время, мин Контрольный глаз □ Тестовый глаз Рис. 4. Влияние мелатонина и соединения 1 на ВГД интактных крыс, % (среднее ±SD, n = 3) Соединение отличается низкой цитотоксичностью по отношению к фибробластам крыс. Согласно расчетным данным, оно обладает достаточной способностью проникать через роговицу глаза. При местном применении соединение 1 в концентрации 0,4 % приводило к снижению внутриглазного давления исследуемых животных на (40,9 ± 6,4) %, при этом не проявляя системное действие и превосходя по офтальмогипотензивной активности препарат сравнения мелатонин, (28,0 ± 11,3) %. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, исследованные производные 3-арилиден-2-оксиндола, которые являются биоизосте-р ам и мелатонин а, проявили себя как перспективный класс соединений при поиске новых лекарственных средств для терапии заболеваний глаза, связанных с повышенным ВГД или оксидативным стрессом, таких как глаукома, увеит и диабетическая ретинопатия, а также могут быть использованы в качестве фармакофоров с целью модификации структур и получения более эффективных соединений.

About the authors

A. A Spasov

Volgograd State Medical University

Email: aspasov@mail.ru
Doctor of Medical Sciences, Professor, Academician of the Russian Academy of Sciences Volgograd, Russia

L. V. Naumenko

Volgograd State Medical University

Email: milanaumenko@mail.ru
MD, Associate Professor, Professor of the Department of Pharmacology and Bioinformatics Volgograd, Russia

D. S Yakovlev

Volgograd State Medical University; Volgograd Medical Scientific Center

MD, Associate Professor, Professor of the Department of Pharmacology and Bioinformatics, Volgograd State Medical University, Senior Researcher at the Laboratory of Experimental Pharmacology Volgograd, Russia

A. S Taran

Volgograd State Medical University; Volgograd Medical Scientific Center

Email: alena-beretta-taran@mail.ru
Candidate of Medical Sciences, Associate Professor of the Department of Pharmacology and Bioinformatics, Volgograd State Medical University, Junior Researcher at the Laboratory of Experimental Pharmacology, Volgograd Medical Research Center Volgograd, Russia

E. V Sokolova

Volgograd State Medical University

Email: sokolova210795@gmail.com
Postgraduate Student of the Department of Pharmacology and Bioinformatics Volgograd, Russia

V. G Klochkov

Volgograd State Medical University

Email: klochkovvladlen@gmail.com
Candidate of PharmaceuticaL Sciences, Assistant of the Department of PharmacoLogy and Bioinformatics Volgograd, Russia

A. V Borisov

Volgograd State Medical University

Email: borissow1978@rambler.ru
Researcher at the Laboratory of Cardiovascular Drugs, Research Center for Innovative Medicines with Pilot Production Volgograd, Russia

E. N Bezsonova

Lomonosov Moscow State University

Email: zetsu45999@mail.ru
Postgraduate Student of the Department of Medical Chemistry and Fine Organic Synthesis of the Faculty of Chemistry Moscow, Russia

A. M Efremov

Lomonosov Moscow State University

Email: sash-ka.e@yandex.ru
Postgraduate Student of the Department of Medical Chemistry and Fine Organic Synthesis of the Faculty of Chemistry Moscow, Russia

N. A Lozinskay

Lomonosov Moscow State University

Email: natalylozinskaya@mail.ru
Candidate of Chemical Sciences, Associate Professor of the Department of Medical Chemistry and Fine Organic Synthesis, Faculty of Chemistry Moscow, Russia

D. A Babkov

Volgograd State Medical University

Email: denis.a.babkov@gmail.com
Candidate of Chemical Sciences, Associate Professor of the Department of Pharmacology and Bioinformatics, Senior Researcher at the Laboratory of Metabotropic Medicines, Research Center for Innovative Medicines with Pilot Production Volgograd, Russia

References

Supplementary files