ИЗМЕНЕНИЯ ИОННЫХ ТОКОВ НЕЙРОНОВ МОЛЛЮСКОВ ПОД ВЛИЯНИЕМ СУКЦИКАРДА

Полный текст

Структурные аналоги гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) пирацетам, фенибут, фенотропил облада- ка, ионные каналы которых имеют принципиальное сходют выраженным нейротропным действием, а их соли и ство с нейронами теплокровных животных [6]. композиции с органическими карбоновыми кислотами превосходят по эффективности исходные вещества [4, МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ 5, 6, 7, 10]. Сукцикард (композиция фенотропила и ян- Объектом исследования были неидентифицировантарной кислоты в соотношении 2 : 1) обладает выра- ные изолированные нейроны моллюсков — прудовика женной нейро- и кардиопротекторной активностью, его большого (Lymnaea stagnais) и катушки роговой (Planorbarius влияние на ионные токи, через которые могут опосре- corneus) [2, 3]. Использовали растворы с различным иондоваться нейро- и психотропные эффекты, не изучены. ным составом (табл.). Перфузирующий (наружный) раствор подавался в камеру, где находился нейрон на полиэтиле-ЦЕЛЬ РАБОТЫ новой микропипетке, а диализирующий (внутриклето-Исследование изменений натриевых, кальциевых чный)—внутрь этой пипетки. Исследуемые вещества дои калиевых ионных токов под влиянием сукцикарда в бавлялись в перфузирующий раствор. Для измерения Ионный состав растворов для регистрации ионных токов и мембранных потенциалов, в мМ Ионные токи NaCl CsCl CaCl2 MgCl2 KCl Tris-ОН рН Внеклеточный раствор Общий входящий ток и регистрация внутриклеточных потенциалов 100 - 2 1,5 5 5 7,5 Кальциевый входящий ток — 100 10 1,5 — 5 7,5 Калиевый выходящий ток 100 — 2 1,5 5 5 7,5 Внутриклеточный раствор Входящие токи — 120 — — — 5 7,4 Калиевые выходящие токи — — — — 120 5 7,4 Выпуск 4 (44). 2012 27 трансмембранных ионных токов применялся метод внутриклеточной перфузии изолированных нейронов и фиксации мембранного потенциала [1, 2, 3]. Для исследования использовали субстанцию сукцикарда, которая растворялась в соответствующих наружных растворах в концентрациях 1, 10, 100 и 1000 мкМ. Кривые ионных токов и потенциалов визуально оценивали на экране осциллографа, с помощью преобразователя АЦП — ЦАП вводили в компьютер и распечатывали на принтере. 12-разрядный ЦАП позволял регистрировать малейшие изменения в амплитудах токов. Результаты обрабатывали с использованием статистической программы SPSS-17, при этом для проверки гипотезы о различиях между группами проводили непараметрический дисперсионный анализ Фридмана, а для доказательства различий между контролем и эффектами фармакологических средств в различных концентрациях — апостериорное попарное сравнение с использованием критериев Вилкоксона. Для оценки каждого изменения тока при определенной концентрации использовали 5—10 измерений. На графиках представлены значения средних арифметических и 95 % доверительные интервалы. Для построения графиков использовали пакет программ «Excel». РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Сукцикард вызывал незначительные, зависимые от концентрации и обратимые изменения амплитуды натриевого тока (рис. 1). В концентрациях 1 и 10 мкМ происходило увеличение или наблюдалась тенденция к увеличению тока на 1,5—2 % (рис. 1А), 100 мкМ — проявлялась тенденция подавления тока, а в концентрации 1000 мкМ — подавление тока на 10—12 %. Эффекты наступали быстро, устранялись при отмывании за 2—3 мин, что указывает на невысокую прочность связывания соедине ния со структурами мембраны (или ионных каналов). Сукцикард не изменял кинетику развития тока (рис. 1 Б) и положение максимума вольт-амперной характеристики мембраны (рис. 1 В). В концентрациях от 1 до 1000 мкМ наблюдалось зависимое от концентрации преимущественно активирующее влияние на кальциевые токи (увеличение амплитуды на 3—10 %) (рис. 2А), оно было выражено в большей степени, чем для натриевых токов. Кинетика развития тока (рис. 2Б) и положение максимума вольт-амперной характеристики мембраны (рис. 2В и 2Г) не изменялись. Нужно обратить внимание на то, что сукцикард при действии в концентрации 1000 мкМ в большей степени подавлял натриевые токи (рис. 1А), чем кальциевые (рис. 2А). На рис. 1В показано, что на суммарной натрий-кальциевой вольт-амперной характеристике мембраны левая часть кривой, отражающая натриевый ток, подавлена сукцикардом в концентрации 1000 мкМ в большей степени, чем правая часть, связанная с кальциевым током. Влияние сукцикарда на медленные калиевые токи (рис. 3А) было также зависимым от концентрации, обратимым и двухфазным: наблюдалась небольшая активация (повышение амплитуд тока на 1,5— 3,6 % при концентрациях 1—10 мкМ) и подавление на 5—13 % при действии в концентрации 1000 мкМ. Восстановление токов в процессе отмывания нейронов происходило так же, как для кальциевых и натриевых токов довольно быстро — за 2—3 мин. Кинетика активации и инактивации тока под влиянием сукцикарда не изменялась (рис. 3Б), положение вольт-амперной характеристики мембраны на оси потенциалов не изменялось, что указывает на отсутствие влияния сукцикарда как на воротные механизмы каналов, так и на потенциал поверхностного заряда мембраны нейронов. 110 105 100 95 90 85 I-H I—I nh 10 100 С, MкМ 1000 А — зависимость «концентрация — эффект». Б — изменения амплитуды и кинетики тока при действии сукцикарда, кривые снизу вверх: 1 — отмывание, 2 — контроль, 3 — сукцикард 100 мкМ, 4 —1000 мкМ. В — вольт-амперные характеристики натрий-кальциевых каналов, кривые снизу вверх: 1 и 2 — контроль и отмывание (кривые сливаются), 3 — 1000 мкМ. По оси абсцисс: А — концентрация, Б — время, В — пилообразное смещение мембранного потенциала от —40 до 30 мВ за 20 мс; по оси ординат — ионный ток (А: I — при действии вещества, I0 — до действия, %); Б — натриевый ток (INa); В — натрий-кальциевый ток; доверительные интервалы при р = 95 %. Рис. 1. Изменения натриевого тока нейронов прудовика под влиянием сукцикарда (n = 7) 28 Выпуск 4 (44). 2012 -20 J А — зависимость «концентрация — эффект». Б — изменения амплитуды и кинетики тока при действии сукцикарда, кривые снизу вверх: 1 — отмывание, 2 — контроль, 3 — сукцикард 100 мкМ, 4 —1000 мкМ. В — вольт-амперные характеристики при действии сукцикарда, кривые снизу вверх: 1 — контроль, 2 — отмывание, 3 — 100, 4 — 1000 мкМ. По оси абсцисс: А — концентрация препарата, Б — время, В — пилообразное смещение мембранного потенциала от —40 до 50 мВ длительностью 100 мс; по оси ординат — ионный ток (А: I — при действии вещества, I0 — до действия, %); Б и В: ICa — кальциевый ток; доверительные интервалы при р = 95 %. Рис. 2. Изменения кальциевого тока нейронов прудовика под влиянием сукцикарда (η = 7) 105 100 £ 95 - 90 85 Z *л ш 10 100 С. мкМ 1000 А — зависимости «концентрация — эффект». Б — изменения амплитуды и кинетики медленного тока под влиянием сукцикарда: 1 — 1000 мкМ, 2 — 100 мкМ, 3 — контроль, 4 — 1 мкМ. В — вольт-амперные характеристики быстрых и медленных токов при действии сукцикарда; под левой стрелкой — быстрый калиевый ток, кривые сверху вниз: 1 — 10 мкМ, 2 — 100 мкМ, 3 — контроль, 4 — 1000 мкМ; справа — медленный калиевый ток: 1 — 1000 мкМ, 2 — 100 мкМ, 3 — контроль, 4 — 1 мкМ. По оси абсцисс: А — концентрация; Б — время: слева до стрелки — Т 1, далее — Т 2; В — пилообразное смещение мембранного потенциала от —40 до 50 мВ длительностью 100 мс; по оси ординат: ионные токи: (А: I — при действии вещества, I0 — до действия, %); Б — I Ks — медленный калиевый ток, В — I K — суммарные калиевые токи (быстрый и медленный); доверительные интервалы при р = 95 %. Рис. 3. Изменения калиевых ионных токов нейронов прудовика под влиянием сукцикарда (n = 10) Характер влияния сукцикарда на быстрые калиевые токи напоминал их влияние на медленные калиевые. Общий характер подавления выходящих быстрых и медленных калиевых ионных токов для сравнения показан на рис. 3В. В самом начале на записи после возникновения емкостных токов мембраны (кривые направлены вверх — под стрелкой) следуют небольшие по амплитуде выходящие быстрые калиевые токи, их амплитуда под влиянием сукцикарда изменялась незначительно. Затем следуют линейно нарастающие выходящие медленные калиевые токи (над стрелкой), которые изменялись в большей степени. В самом конце в правой части записи снова видны емкостные токи мембраны, направленные вниз и возникающие на выключение линейно нарастающего деполяризующего смещения потенциала. Неспецифические токи утечки мембраны при действии сукцикарда во всем диапазоне исследованных концентраций (1—1000 мкМ) и при регистрации всех ионных токов либо изменялись незначительно (на 0,5—1 нА), либо оставались неизменными, поэтому характерных изменений тока утечки мембраны установить не удалось. Наши результаты о незначительном увеличении амплитуды трансмембранных ионных токов нейронов под влиянием сукцикарда в концентрациях 1—10 мкМ можно расценивать как активирующие. При этом активация была выражена преимущественно для кальциевых токов. Этот факт указывает на то, что в клетке под влиянием сукцикарда могут возникать многообразные Выпуск 4 (44). 2012 29 модулирующие эффекты — вплоть до активации геномного аппарата, а в синаптических окончаниях — усиленный выброс медиаторов. А поскольку процесс синаптической пластичности связан с повышением концентрации ионов кальция в постсинаптической клетке, который запускает каскад белок-белковых взаимодействий, приводящих в конечном итоге к структурным изменениям в нейроне [2], то полученный нами факт приобретает важное значение для понимания механизмов мембранотропного действия нейромодуляторных ноотропных средств. Подавление всех ионных токов [9] при действии мембраноактивных веществ примерно в равной степени и в равных концентрациях можно называть неспецифическим (неизбирательным) их влиянием на ионные каналы. Многие соединения подавляют кальциевые, натриевые и калиевые ионные токи, но вместе с тем часто выявляются и индивидуальные черты их действия [2, 3]. Например, анксиолитик афобазол, обладающий и противоаритмическими свойствами, способен блокировать ионные каналы [8]. Из ноотроп-ных средств пирацетам на нейронах моллюска виноградной улитки в концентрации 1—2 мМ подавляет калиевые токи почти на 50 % [10]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Сукцикард в концентрациях 1, 10, 100 и 1000 мкМ дозозависимо и обратимо изменяет трансмембранные натриевые, кальциевые и калиевые ионные токи нейронов моллюсков прудовика и катушки, проявляя мем-бранотропную активность при внеклеточном действии. Сукцикард в концентрациях 1—10 мкМ увеличивает амплитуду кальциевых и калиевых токов на 2—10 %, не изменяя амплитуду натриевых; 100 мкМ — увеличивает амплитуду кальциевых токов на 5—10 %, не оказывая влияния на натриевые и калиевые; 1000 мкМ — подавляет амплитуду натриевых и калиевых токов на 5—12 %, не оказывая влияния на кальциевые. Сукцикард не вызывает сдвигов вольт-амперных характеристик мембраны для всех токов; не влияет на потенциал поверхностного заряда мембраны вблизи ионных каналов и кинетику активации/инактивации ионных то ков, что свидетельствует об отсутствии его влияния на воротные механизмы ионных каналов. Быстрая обратимость эффектов после действия сукцикарда в течение 2—3 мин указывает на относительно непрочное связывание его молекул со структурами мембраны и ионных каналов.

Об авторах

Анатолий Иванович Вислобоков

Институт фармакологии им. А. В. Вальдмана, СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова

Email: vislobokov@yandex.ru
д. б. н., заведующий отделом нейрофармакологии

Ю. Д. Игнатов

И. Н. Тюренков

В. В. Багметова

Список литературы

Дополнительные файлы