УДЕЛЬНОЕ ЧИСЛО КЛЕТОК И ИНТЕНСИВНОСТЬ ЭКСПРЕССИИ ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ НИТРОКСИДСИНТАЗЫ В ТКАНЯХ ЖЕЛУДКА В ЗОНЕ ИЗЪЯЗВЛЕНИЯ И УРОВЕНЬ ВНУТРИЭРИТРОЦИТАРНОГО МАГНИЯ У СТРЕССУСТОЙЧИВЫХ И СТРЕССНЕУСТОЙЧИВЫХ КРЫС

Полный текст

ЦЕЛЬ РАБОТЫ Определить число и интенсивность экспрессии eNOS-позитивных клеток в тканях зоны язвенного дефекта и содержание магния в эритроцитарной массе крови из подключичной вены у стрессустойчивых и стресснеустойчивых крыс с экспериментальными язвами желудка. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты выполнены на 40 белых крысах линии Вистар обоего пола, предварительно разделенных методом открытого поля на группу стрессустойчивых и стресснеустойчивых, в каждой из которых проводили по 5 серий экспериментов. Первую серию составляли ин-тактные животные; во второй контрольной - имитировали моделирование ацетатной язвы; в третьей-моделировали ацетатную язву в препилорической зоне по методу Окабэ С., 2005 [4]. В четвертой серии воспроизводили «стрессовые» язвы по Брехману А. (1976). В пятой серии моделировали острый стресс у животных со сформировавшейся ацетатной язвой желудка. Всех животных выводили из эксперимента через 7 суток от его начала, кроме крыс 4-й серии, где эксперимент завершался через 3 суток, визуально оценивая площадь язвы с последующим забором ткани из зоны язвенного де фекта для иммуногистохимического исследования. Для идентификации эндотелиальной нитроксидсинтазы использовались моноклональные антитела к eNOS («Novocastra», Великобритания). Оценка реакции проводилась полуколичественным методом с учетом интенсивности окрашивания (негативная реакция - «0»; слабо позитивная - «1»; умеренно позитивная - «2»; сильно позитивная - «3»), а также удельного числа ан-тиген-позитивных клеток в поврежденных тканях желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) [3]. Концентрацию магния (Mg2+) в эритроцитарной массе крови из подключичной вены (Vs) как условие оптимизации активации eNOS определяли по Камышникову В. С. (2004 г.) [1]. Для статистической обработки результатов исследования при нормальном распределении использовали критерий Стью-дента (M ± m), при распределении отличном от нормального - критерий Уилкоксона при уровне значимости Q < 0,05 (Me [25 и 75 перцентили]). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Результаты представлены в табл. 1, 2. У стрессустойчивых крыс 3-й серии формировалась язва площадью (38,72 ± 4,09) мм2, при остром стрессировании в этой группе размер язвы составил (8,47 ± 1,4) мм2. Выпуск 1 (45). 2013 61 Dsempfia Щ1 Таблица 1 Площадь язвы и содержание 1^2+в эритроцитах крови из Vs (M ± m) Показатель Исходное состояние Р Контроль Р Ацетатная язва Р Стрессовая язва Р Ацетатная язва после воздействия острого стресса Р Устойчивость к стрессу + - + - + - + - + - Площадь язвенного дефекта, мм2 38,72 ± 4,09 68,70 ± 9,44 < 0,05 8,47 ± 1,40 15,83 ± 2,93 < 0,05 39,00 ± 3,7' 79,63 ± 16,94 < 0,05 Mg2+ в эритроцитарной массе крови из Vs, ммоль/л 1,420 ± 0,101 1,910 ± 0,074 <0,001 1,750 ± 0,094* 2,150 ± 0,184 >0,1 1,210 ± 0,012** 1,480 ± 0,175## >0,1 2,120 ± 0,268*** 1,220 ± 0,035### <0,01 1,900 ± 0,143**** 2,110 ± 0,168#### >0,1 Примечание. + - стрессустойчивые крысы;--стресснеустойчивые крысы; Р - достоверность различий между показателями у крыс с разной устойчивостью к стрессу Достоверность различий показателей между контролем и исходным состоянием: *у стрессустойчивых крыс (Р < 0,05); между ацетатной язвой и контролем: **у стрессустойчивых крыс (Р < 0,001), ##у стресснеустойчивых крыс (Р < 0,05); между стрессовой язвой и исходным состоянием: ***у стрессустойчивых крыс (Р < 0,05), ###у стресснеустойчивых крыс (Р < 0,001); между ацетатной язвой после воздействия острого стресса и ацетатной язвой: ****у стрессустойчивых крыс (Р < 0,001), ####у стресснеустойчивых крыс (Р < 0,05). Таблица 2 Удельное число и интенсивность экспрессии eNOS-позитивных клеток (Me[25 и 75 перцентили]) Характеристика eNOS Исходное состояние Q Контроль Q Ацетатная язва Q Стрессовая язва Q Ацетатная язва после воздействия острого стресса Q Устойчивость к стрессу + - + - + - + - + - СОЖ интен сивность экспрес сии 1 [1; 1] 2 [2; 2] <0,05 3 [3; 3]* 3 [3# 3]# - 2 [2; 2]** 1 [1; 1]## <0,05 2 [2; 2]*** 3 [3; 1 <0,05 3 [3; 3]**** 3 [2, 75; 3]#### удельное число 65 [50; 82, 5] 17,5 [10; 25] <0,05 7,5 [4; 11, 25]* 12,5 [8, 75; 15] - 22,5 [20; 27, 5]** 12,5 [10; 15] <0,05 30 [28, 75; 31, 25]*** 5 [4, 5; 5]### <0,05 32,5 [12, 5; 55] 7,5 [4; 15] - Подсли зистая основа Интен сивность экспрес сии 0 [0; 0, 75] 1 [0, 75 1] - 1 [1; 1] 1 [0; 2, 25] - 2 [1, 5; 2] 0 [0; 0, 25] - 2 [1, 5; 2, 25] 2 [1, 5; 2] - 2 [2; 2] 0 [0; 0, 5] - Удельно е число 0 [0; 12, 5] 10 [7, 5; 10] - 5 [5; 6, 25] 5 [0; 10] - 3 [1; 2] 0 [0; 1, 25] - 7,5 [3, 75; 10] 5 [3, 75; 6, 25] - 5 [5; 6, 25] 0 [0; 3, 75] - Примечание. + - стрессустойчивые крысы;--стресснеустойчивые крысы; Q - достоверность различий между показателями у крыс с разной устойчивостью к стрессу (Q < 0,05). Достоверность различий показателей (Q < 0,05) между контролем и исходным состоянием: *у стрессустойчивых крыс, #у стресснеустойчивых крыс; между ацетатной язвой и контролем: **у стрессустойчивых крыс, стресснеустойчивых крыс; между стрессовой язвой и исходным состоянием: ***у стрессустойчивых крыс, стресснеустойчивых крыс; между ацетатной язвой после воздействия острого стресса и ацетатной язвой: неустойчивых крыс. *у стрессустойчивых крыс, стресс- У крыс со сформировавшейся ацетатной язвой под влиянием острого стресса по отношению к животным с ацетатной язвой площадь язвы оставалась практически такой же - (39,0 ± 3,71) мм2 (табл. 1). При ацетатной язве желудка у стрессустойчивых животных число eNOS-позитивных клеток слизистой оболочки желудка (СОЖ) повышалось (Q < 0,05), но интенсивность экспрессии снижалась по отношению к контрольной серии крыс. Одновременно в эритроцитах крови из Vs содержание Mg2+ снижалось на 30,9 % (р < 0,001). Выявлена прямая заметная связь между содержани ем внутриэритроцитарного Mg2+ и числом иммуно-позитивных клеток в СОЖ (r = 0,7). После воздействия острого стресса в этой же группе крыс число eNOS-позитивных клеток снизилось в СОЖ, но интенсивность экспрессии увеличилась по отношению к исходному состоянию (Q < 0,05). Одновременно было выявлено увеличение на 49,3 % (Р < 0,05) концентрации внутриэритроцитарного Mg2+ в крови из Vs. При остром стрессе определялась прямая корреляционная связь между площадью язвы и числом имму-нопозитивных клеток в СОЖ (r = 0,69). Увеличение 62 Выпуск 1 (45). 2013 ©згиирСз [ЩсапГг'ГОМЩ площади язвы, коррелирующее с числом и интенсивностью экспрессии нитроксидсинтазы в СОЖ, может быть связано с нарушением сопряжения L-аргинина и eNOS. Снижение транспорта и метаболизма L-аргинина при одновременном увеличении активности eNOS ведет к образованию супероксид-аниона. При этом количество синтезированного NO резко снижается, создавая предпосылки к усилению изъязвления слизистой оболочки желудка [2]. У стрессустойчивых животных со сформировавшейся ацетатной язвой после воздействия острого стресса по отношению к крысам с ацетатной язвой желудка была выявлена достоверная сверхэкспрессия и недостоверное увеличение количества eNOS-позитивных клеток в СОЖ на фоне повышенного уровня Mg2+ в эритроцитарной массе крови из Vs на 57,0 % (Р < 0,001). Выявлены следующие корреляционные взаимосвязи: между площадью язвы и удельным числом eNOS-позитивных клеток в СОЖ - прямая весьма высокая (г = 0,98); между содержанием внутриэритроцитарного Mg2+ в крови из Vs и удельным числом eNOS-позитивных клеток в СОЖ - прямая умеренная (г = 0,46). У стресснеустойчивых крыс площадь ацетатной язвы составила (68,7 ± 9,44) мм2, моделирование стрессовой язвы в этой же группе животных вызывало появление дефекта площадью (15,83 ± 2,93) мм2. При воздействии острого стресса на животных со сформировавшейся ацетатной язвой площадь язвы составила (79,63 ± 16,94) мм2 (табл. 1). На фоне ацетатной язвы при сравнении с контрольной серией отмечалось снижение как числа, так и интенсивности окрашивания eNOS-позитивных клеток в СОЖ (Q < 0,05) с одновременным снижением на 31,2 % (Р < 0,05) концентрации Mg2+ в эритроцитах крови из Vs. Между площадью язвы и числом eNOS-позитивных клеток в СОЖ выявлена прямая связь (г = 0,63); между концентрацией Mg2+ в эритроцитах крови из Vs и числом клеток в СОЖ -прямая зависимость (г = 0,37).На фоне острого стресса уменьшалось число клеток, экспрессирующихeNOS в СОЖ, с увеличением интенсивности экспрессии (Q < 0,05). Одновременно было выявлено снижение на 36,1 % (Р < 0,001) концентрации Mg2+ в эритроцитах из Vs. Корреляционные взаимоотношения были следующими: между площадью язвы и числом иммунопози-тивных клеток в СОЖ - прямые умеренные (г = 0,41); между содержанием Mg2+ в эритроцитах крови из Vs и числом eNOS-позитивных клеток в СОЖ - прямые высокие (г = 0,73), по отношению к интенсивности окрашивания клеток в СОЖ-обратные (г = -0,82). Острое стрессирование крыс с уже сформировавшейся ацетатной язвой по сравнению с животными с ацетатной язвой приводило к увеличению интенсивности иммуно-гистохимической реакции на фоне практически неизмененного числа eNOS-позитивных клеток в СОЖ и выраженного увеличения концентрации Mg2+ в эритроцитах крови из Vs на 42,6 % (Р < 0,05). Между интенсивностью экспрессии eNOS-позитивных клеток в СОЖ и пло щадью язвы определена прямая заметная связь (г = 0,65); между содержанием Mg2+ в эритроцитах крови из Vs и удельным числом eNOS-позитивных клеток в СОЖ - прямая связь - г = 0,42, по отношению к выраженности экспрессии в СОЖ - г = 0,77. При ацетатной язве было выявлено, что у стрессустойчивых по отношению к стресснеустойчивым крысам площадь язвы была меньше на 43,6 % (Р < 0,05). При этом у стресснеустойчивых крыс была менее выраженная интенсивность и более низкое число eNOS-позитивных клеток в СОЖ по сравнению со стрессус-тойчивыми животными на фоне практически одинаковой концентрации Mg2+ в эритроцитах крови из Vs. При остром стрессе у стрессустойчивых животных по сравнению со стресснеустойчивыми крысами площадь язвы была меньше на 46,5 % (Р < 0,05). При этом у стресснеустойчивых животных по отношению к устойчивым крысам определялось более низкое число клеток, экспрессирующих eNOS в СОЖ, но интенсивность экспрессии была выше на фоне значительной на 73,8 % (Р < 0,01) задержки Mg2+ в эритроцитарном пуле крови из Vs. Острое стрессирование обеих групп животных со сформировавшейся ацетатной язвой сопровождалось появлением язвы меньшей площади у стрессустойчивых крыс на 51 % (Р < 0,05) по отношению к неустойчивых животным, которые при этом отличались от устойчивых крыс недостоверным снижением интенсивности и числа eNOS-позитивных клеток в СОЖ на фоне меньшей концентрацией Mg2+ в эритроцитарной массе крови из Vs на 10 % (Р > 0,1). Таким образом, у стрессустойчивых крыс меньшая площадь язвенного дефекта при ацетатной язве и ацетатной язве, сформировавшейся на фоне острого стресса, сопровождается большим числом eNOS-позитивных клеток в СОЖ, обеспечивающих адекватный уровень кровоснабжения стенки желудка, что приводит к меньшему повреждению слизистой оболочки и более интенсивной реализации процессов заживления поврежденных тканей ЖКТ. На фоне острого стресса формирование язвы меньшей площади у стрессустойчивых крыс также ассоциирует со значительным числом eNOS-позитивных клеток в СОЖ. Обращает на себя внимание, что при критически малом числе нит-роксидпозитивных клеток в СОЖ у стресснеустойчивых крыс, видимо, как проявление адаптационных процессов усиливается интенсивность ее экспрессии. Полученные данные позволяют утверждать, что в процессе стресс-реакции происходит не только и не столько истощение активности нитроксидсинтазы, приводящее к ишемии слизистой, сколько врожденный или приобретенный дефицит этого фермента в тканях ЖКТ. Стойкая высокая зависимость площади изъязвления от числа и интенсивности экспрессии eNOS в тканях желудка вне зависимости от этиологического фактора изъязвления делает этот показатель одним из важных патогенетических механизмов формирования язвенных дефектов. Выпуск 1 (45). 2013 63 Анализ содержания магния в эритроцитах крови на фоне язвенных дефектов ацетатной и стрессовой природы выявляет разнонаправленные изменения. Сравнительное исследование уровня внутриклеточного магния у стрессустойчивых и неустойчивых крыс с ацетатной язвой и ацетатной язвой, сформировавшейся на фоне острого стресса, значимой разницы не выявляет. Однако у стресснеустойчивых крыс со стрессовой язвой резко падает уровень внутриклеточного магния, что на фоне малого числа eNOS-позитивных клеток создает оптимальные условия для изъязвления слизистой ЖКТ Во-первых, потому что дефицит магния вызывает нарушение механизмов вазодилатации. Во-вторых, его дефицит как активатора более 300 ферментов, в том числе и в первую очередь энергообразования и энерогопотребления, создает предпосылки для снижения интенсивности пролиферации. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проведенное исследование позволяет сделать вывод, что при формировании экспериментальных язв стрессовой и химической природы у стресснеустойчивых крыс по отношению к устойчивым площадь язвенного дефекта больше на фоне меньшего числа клеток в слизистой оболочке желудка, экспрессиру ющих eNOS, и практически одинаковой концентрации внутриэритроцитарного магния в крови. Только в условиях острого стресса у стресснеустойчивых животных выявлена более значительная потеря магния эритроцитами крови по сравнению со стрессустойчи-выми крысами.

Об авторах

Виктория Николаевна-ассистент Поветкина

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: vnpovetkina@gmail.com
кафедры патологической физиологии

Л. Н. Рогова

Волгоградский государственный медицинский университет

кафедра патологической физиологии

Список литературы

Дополнительные файлы