SPECIFIC NUMBER OF CELLS AND INTENSITY OF ENDOTHELIAL NITRIC OXIDE SYNTHASE EXPRESSION IN THE STOMACH TISSUES OF THE ULCERATION AREA AND INTRAERYTHROCYTIC MAGNESIUM LEVEL IN STRESS RESISTANT AND STRESS NONRESISTANT RATS

Full Text

ЦЕЛЬ РАБОТЫ Определить число и интенсивность экспрессии eNOS-позитивных клеток в тканях зоны язвенного дефекта и содержание магния в эритроцитарной массе крови из подключичной вены у стрессустойчивых и стресснеустойчивых крыс с экспериментальными язвами желудка. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты выполнены на 40 белых крысах линии Вистар обоего пола, предварительно разделенных методом открытого поля на группу стрессустойчивых и стресснеустойчивых, в каждой из которых проводили по 5 серий экспериментов. Первую серию составляли ин-тактные животные; во второй контрольной - имитировали моделирование ацетатной язвы; в третьей-моделировали ацетатную язву в препилорической зоне по методу Окабэ С., 2005 [4]. В четвертой серии воспроизводили «стрессовые» язвы по Брехману А. (1976). В пятой серии моделировали острый стресс у животных со сформировавшейся ацетатной язвой желудка. Всех животных выводили из эксперимента через 7 суток от его начала, кроме крыс 4-й серии, где эксперимент завершался через 3 суток, визуально оценивая площадь язвы с последующим забором ткани из зоны язвенного де фекта для иммуногистохимического исследования. Для идентификации эндотелиальной нитроксидсинтазы использовались моноклональные антитела к eNOS («Novocastra», Великобритания). Оценка реакции проводилась полуколичественным методом с учетом интенсивности окрашивания (негативная реакция - «0»; слабо позитивная - «1»; умеренно позитивная - «2»; сильно позитивная - «3»), а также удельного числа ан-тиген-позитивных клеток в поврежденных тканях желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) [3]. Концентрацию магния (Mg2+) в эритроцитарной массе крови из подключичной вены (Vs) как условие оптимизации активации eNOS определяли по Камышникову В. С. (2004 г.) [1]. Для статистической обработки результатов исследования при нормальном распределении использовали критерий Стью-дента (M ± m), при распределении отличном от нормального - критерий Уилкоксона при уровне значимости Q < 0,05 (Me [25 и 75 перцентили]). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Результаты представлены в табл. 1, 2. У стрессустойчивых крыс 3-й серии формировалась язва площадью (38,72 ± 4,09) мм2, при остром стрессировании в этой группе размер язвы составил (8,47 ± 1,4) мм2. Выпуск 1 (45). 2013 61 Dsempfia Щ1 Таблица 1 Площадь язвы и содержание 1^2+в эритроцитах крови из Vs (M ± m) Показатель Исходное состояние Р Контроль Р Ацетатная язва Р Стрессовая язва Р Ацетатная язва после воздействия острого стресса Р Устойчивость к стрессу + - + - + - + - + - Площадь язвенного дефекта, мм2 38,72 ± 4,09 68,70 ± 9,44 < 0,05 8,47 ± 1,40 15,83 ± 2,93 < 0,05 39,00 ± 3,7' 79,63 ± 16,94 < 0,05 Mg2+ в эритроцитарной массе крови из Vs, ммоль/л 1,420 ± 0,101 1,910 ± 0,074 <0,001 1,750 ± 0,094* 2,150 ± 0,184 >0,1 1,210 ± 0,012** 1,480 ± 0,175## >0,1 2,120 ± 0,268*** 1,220 ± 0,035### <0,01 1,900 ± 0,143**** 2,110 ± 0,168#### >0,1 Примечание. + - стрессустойчивые крысы;--стресснеустойчивые крысы; Р - достоверность различий между показателями у крыс с разной устойчивостью к стрессу Достоверность различий показателей между контролем и исходным состоянием: *у стрессустойчивых крыс (Р < 0,05); между ацетатной язвой и контролем: **у стрессустойчивых крыс (Р < 0,001), ##у стресснеустойчивых крыс (Р < 0,05); между стрессовой язвой и исходным состоянием: ***у стрессустойчивых крыс (Р < 0,05), ###у стресснеустойчивых крыс (Р < 0,001); между ацетатной язвой после воздействия острого стресса и ацетатной язвой: ****у стрессустойчивых крыс (Р < 0,001), ####у стресснеустойчивых крыс (Р < 0,05). Таблица 2 Удельное число и интенсивность экспрессии eNOS-позитивных клеток (Me[25 и 75 перцентили]) Характеристика eNOS Исходное состояние Q Контроль Q Ацетатная язва Q Стрессовая язва Q Ацетатная язва после воздействия острого стресса Q Устойчивость к стрессу + - + - + - + - + - СОЖ интен сивность экспрес сии 1 [1; 1] 2 [2; 2] <0,05 3 [3; 3]* 3 [3# 3]# - 2 [2; 2]** 1 [1; 1]## <0,05 2 [2; 2]*** 3 [3; 1 <0,05 3 [3; 3]**** 3 [2, 75; 3]#### удельное число 65 [50; 82, 5] 17,5 [10; 25] <0,05 7,5 [4; 11, 25]* 12,5 [8, 75; 15] - 22,5 [20; 27, 5]** 12,5 [10; 15] <0,05 30 [28, 75; 31, 25]*** 5 [4, 5; 5]### <0,05 32,5 [12, 5; 55] 7,5 [4; 15] - Подсли зистая основа Интен сивность экспрес сии 0 [0; 0, 75] 1 [0, 75 1] - 1 [1; 1] 1 [0; 2, 25] - 2 [1, 5; 2] 0 [0; 0, 25] - 2 [1, 5; 2, 25] 2 [1, 5; 2] - 2 [2; 2] 0 [0; 0, 5] - Удельно е число 0 [0; 12, 5] 10 [7, 5; 10] - 5 [5; 6, 25] 5 [0; 10] - 3 [1; 2] 0 [0; 1, 25] - 7,5 [3, 75; 10] 5 [3, 75; 6, 25] - 5 [5; 6, 25] 0 [0; 3, 75] - Примечание. + - стрессустойчивые крысы;--стресснеустойчивые крысы; Q - достоверность различий между показателями у крыс с разной устойчивостью к стрессу (Q < 0,05). Достоверность различий показателей (Q < 0,05) между контролем и исходным состоянием: *у стрессустойчивых крыс, #у стресснеустойчивых крыс; между ацетатной язвой и контролем: **у стрессустойчивых крыс, стресснеустойчивых крыс; между стрессовой язвой и исходным состоянием: ***у стрессустойчивых крыс, стресснеустойчивых крыс; между ацетатной язвой после воздействия острого стресса и ацетатной язвой: неустойчивых крыс. *у стрессустойчивых крыс, стресс- У крыс со сформировавшейся ацетатной язвой под влиянием острого стресса по отношению к животным с ацетатной язвой площадь язвы оставалась практически такой же - (39,0 ± 3,71) мм2 (табл. 1). При ацетатной язве желудка у стрессустойчивых животных число eNOS-позитивных клеток слизистой оболочки желудка (СОЖ) повышалось (Q < 0,05), но интенсивность экспрессии снижалась по отношению к контрольной серии крыс. Одновременно в эритроцитах крови из Vs содержание Mg2+ снижалось на 30,9 % (р < 0,001). Выявлена прямая заметная связь между содержани ем внутриэритроцитарного Mg2+ и числом иммуно-позитивных клеток в СОЖ (r = 0,7). После воздействия острого стресса в этой же группе крыс число eNOS-позитивных клеток снизилось в СОЖ, но интенсивность экспрессии увеличилась по отношению к исходному состоянию (Q < 0,05). Одновременно было выявлено увеличение на 49,3 % (Р < 0,05) концентрации внутриэритроцитарного Mg2+ в крови из Vs. При остром стрессе определялась прямая корреляционная связь между площадью язвы и числом имму-нопозитивных клеток в СОЖ (r = 0,69). Увеличение 62 Выпуск 1 (45). 2013 ©згиирСз [ЩсапГг'ГОМЩ площади язвы, коррелирующее с числом и интенсивностью экспрессии нитроксидсинтазы в СОЖ, может быть связано с нарушением сопряжения L-аргинина и eNOS. Снижение транспорта и метаболизма L-аргинина при одновременном увеличении активности eNOS ведет к образованию супероксид-аниона. При этом количество синтезированного NO резко снижается, создавая предпосылки к усилению изъязвления слизистой оболочки желудка [2]. У стрессустойчивых животных со сформировавшейся ацетатной язвой после воздействия острого стресса по отношению к крысам с ацетатной язвой желудка была выявлена достоверная сверхэкспрессия и недостоверное увеличение количества eNOS-позитивных клеток в СОЖ на фоне повышенного уровня Mg2+ в эритроцитарной массе крови из Vs на 57,0 % (Р < 0,001). Выявлены следующие корреляционные взаимосвязи: между площадью язвы и удельным числом eNOS-позитивных клеток в СОЖ - прямая весьма высокая (г = 0,98); между содержанием внутриэритроцитарного Mg2+ в крови из Vs и удельным числом eNOS-позитивных клеток в СОЖ - прямая умеренная (г = 0,46). У стресснеустойчивых крыс площадь ацетатной язвы составила (68,7 ± 9,44) мм2, моделирование стрессовой язвы в этой же группе животных вызывало появление дефекта площадью (15,83 ± 2,93) мм2. При воздействии острого стресса на животных со сформировавшейся ацетатной язвой площадь язвы составила (79,63 ± 16,94) мм2 (табл. 1). На фоне ацетатной язвы при сравнении с контрольной серией отмечалось снижение как числа, так и интенсивности окрашивания eNOS-позитивных клеток в СОЖ (Q < 0,05) с одновременным снижением на 31,2 % (Р < 0,05) концентрации Mg2+ в эритроцитах крови из Vs. Между площадью язвы и числом eNOS-позитивных клеток в СОЖ выявлена прямая связь (г = 0,63); между концентрацией Mg2+ в эритроцитах крови из Vs и числом клеток в СОЖ -прямая зависимость (г = 0,37).На фоне острого стресса уменьшалось число клеток, экспрессирующихeNOS в СОЖ, с увеличением интенсивности экспрессии (Q < 0,05). Одновременно было выявлено снижение на 36,1 % (Р < 0,001) концентрации Mg2+ в эритроцитах из Vs. Корреляционные взаимоотношения были следующими: между площадью язвы и числом иммунопози-тивных клеток в СОЖ - прямые умеренные (г = 0,41); между содержанием Mg2+ в эритроцитах крови из Vs и числом eNOS-позитивных клеток в СОЖ - прямые высокие (г = 0,73), по отношению к интенсивности окрашивания клеток в СОЖ-обратные (г = -0,82). Острое стрессирование крыс с уже сформировавшейся ацетатной язвой по сравнению с животными с ацетатной язвой приводило к увеличению интенсивности иммуно-гистохимической реакции на фоне практически неизмененного числа eNOS-позитивных клеток в СОЖ и выраженного увеличения концентрации Mg2+ в эритроцитах крови из Vs на 42,6 % (Р < 0,05). Между интенсивностью экспрессии eNOS-позитивных клеток в СОЖ и пло щадью язвы определена прямая заметная связь (г = 0,65); между содержанием Mg2+ в эритроцитах крови из Vs и удельным числом eNOS-позитивных клеток в СОЖ - прямая связь - г = 0,42, по отношению к выраженности экспрессии в СОЖ - г = 0,77. При ацетатной язве было выявлено, что у стрессустойчивых по отношению к стресснеустойчивым крысам площадь язвы была меньше на 43,6 % (Р < 0,05). При этом у стресснеустойчивых крыс была менее выраженная интенсивность и более низкое число eNOS-позитивных клеток в СОЖ по сравнению со стрессус-тойчивыми животными на фоне практически одинаковой концентрации Mg2+ в эритроцитах крови из Vs. При остром стрессе у стрессустойчивых животных по сравнению со стресснеустойчивыми крысами площадь язвы была меньше на 46,5 % (Р < 0,05). При этом у стресснеустойчивых животных по отношению к устойчивым крысам определялось более низкое число клеток, экспрессирующих eNOS в СОЖ, но интенсивность экспрессии была выше на фоне значительной на 73,8 % (Р < 0,01) задержки Mg2+ в эритроцитарном пуле крови из Vs. Острое стрессирование обеих групп животных со сформировавшейся ацетатной язвой сопровождалось появлением язвы меньшей площади у стрессустойчивых крыс на 51 % (Р < 0,05) по отношению к неустойчивых животным, которые при этом отличались от устойчивых крыс недостоверным снижением интенсивности и числа eNOS-позитивных клеток в СОЖ на фоне меньшей концентрацией Mg2+ в эритроцитарной массе крови из Vs на 10 % (Р > 0,1). Таким образом, у стрессустойчивых крыс меньшая площадь язвенного дефекта при ацетатной язве и ацетатной язве, сформировавшейся на фоне острого стресса, сопровождается большим числом eNOS-позитивных клеток в СОЖ, обеспечивающих адекватный уровень кровоснабжения стенки желудка, что приводит к меньшему повреждению слизистой оболочки и более интенсивной реализации процессов заживления поврежденных тканей ЖКТ. На фоне острого стресса формирование язвы меньшей площади у стрессустойчивых крыс также ассоциирует со значительным числом eNOS-позитивных клеток в СОЖ. Обращает на себя внимание, что при критически малом числе нит-роксидпозитивных клеток в СОЖ у стресснеустойчивых крыс, видимо, как проявление адаптационных процессов усиливается интенсивность ее экспрессии. Полученные данные позволяют утверждать, что в процессе стресс-реакции происходит не только и не столько истощение активности нитроксидсинтазы, приводящее к ишемии слизистой, сколько врожденный или приобретенный дефицит этого фермента в тканях ЖКТ. Стойкая высокая зависимость площади изъязвления от числа и интенсивности экспрессии eNOS в тканях желудка вне зависимости от этиологического фактора изъязвления делает этот показатель одним из важных патогенетических механизмов формирования язвенных дефектов. Выпуск 1 (45). 2013 63 Анализ содержания магния в эритроцитах крови на фоне язвенных дефектов ацетатной и стрессовой природы выявляет разнонаправленные изменения. Сравнительное исследование уровня внутриклеточного магния у стрессустойчивых и неустойчивых крыс с ацетатной язвой и ацетатной язвой, сформировавшейся на фоне острого стресса, значимой разницы не выявляет. Однако у стресснеустойчивых крыс со стрессовой язвой резко падает уровень внутриклеточного магния, что на фоне малого числа eNOS-позитивных клеток создает оптимальные условия для изъязвления слизистой ЖКТ Во-первых, потому что дефицит магния вызывает нарушение механизмов вазодилатации. Во-вторых, его дефицит как активатора более 300 ферментов, в том числе и в первую очередь энергообразования и энерогопотребления, создает предпосылки для снижения интенсивности пролиферации. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проведенное исследование позволяет сделать вывод, что при формировании экспериментальных язв стрессовой и химической природы у стресснеустойчивых крыс по отношению к устойчивым площадь язвенного дефекта больше на фоне меньшего числа клеток в слизистой оболочке желудка, экспрессиру ющих eNOS, и практически одинаковой концентрации внутриэритроцитарного магния в крови. Только в условиях острого стресса у стресснеустойчивых животных выявлена более значительная потеря магния эритроцитами крови по сравнению со стрессустойчи-выми крысами.

About the authors

V. N. Povetkina

Email: vnpovetkina@gmail.com

L. N. Rogova

References

Supplementary files