ПРИМЕНЕНИЕ СИСТЕМЫ EZ::TN5 < R6KγORI/KAN-2 > TNP ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСЕРЦИОННЫХ МУТАНТОВ BURKHOLDERIA MALLEI

Полный текст

B. mallei является возбудителем тяжелого заболевания человека и животных-сапа и относится ко второй группе патогенности. В настоящее время проведено полное секвенирование геномов отдельных штаммов этого микроорганизма [9], однако завершенная функциональная аннотация генома B. mallei требует дополнительных исследований роли отдельных генетических детерминант. Транспозонный мутагенез широко используется для изучения функций отдельных генов и механизмов клеточных процессов. Традиционные методики инсерционного мутагенеза основывались на конъюгационной передаче в клетки исследуемого вида микроорганизма плазмиды, несущей в своем составе транспозон и последующей элиминации вектора. Таким способом ранее нами были получены инсерционные мутанты B. mallei посредством передачи плазмиды (pSUP5011), несущей транспозон Tn 5, от Escherichia ooli S 17-1 [1]. Недостатками использованного подхода были значительная временная продолжительность экспериментов и необходимость в подборе условий для последующей элиминации суицидного вектора и селективных сред для исключения роста донорного штамма. В настоящее время для высокоэффективного направленного мутагенеза применяются готовые транспозонные конструкции на основе векторов с высокой частотой передачи и встройки. Такие конструкции, в частности, входят в состав коммерческих наборов для in vitro мутагенеза EZ-Tn5™ <R6Kyori/KAN-2(DGFR)>Transposome™Kit (Epicentre, США) и включают рекомбинантный вектор на основе транспозона Tn5 с областью начала репликации R6Kyori E. coli и детерминантами резистентности к канами-цину (<R6Kyori/KAN-2>) или триметоприму (<DGFR>), а также транспозазу EZ-Tn5™ Transposase, обеспечивающую высокую частоту инсерций транспозона в таргетную последовательность при электропорационной передаче и набор секвенационных праймеров для анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК, фланкирующих область инсерции [5, 6, 7]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Оценка эффективности системы EZ::TN5<R6Kyori/ KAN-2>Tnp для получения инсерционных мутантов B. mallei и их первичная фенотипическая характеристика. Выпуск 4 (56). 2015 85 ЩШгорСз [ЩсмеТКЩ МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Бактериальные штаммы. В качестве исходного при получении инсерционных мутантов был использован штамм B. mallei Ц-5 дикого типа. Штамм E. coli CCUG (Culture Collection, University of Goteborg, Швеция) использовался в качестве контрольного при масс-спектрометрическом профилировании бактериальных клеток. Культуры микроорганизмов выращивали на питательном агаре (Nutrient agar, Himedia; L- agar, Difco) и в питательном бульоне (Nutrient broth, Himedia) при температуре 37 °С. Определение уровня антибиотикорезистентно-сти. Минимальные подавляющие концентрации (МПК) офлоксацина, тетрациклина, канамицина, хлорамфени-кола, цефоперазона определяли на агаре Мюллер-Хинтон (Himedia) методом серийных разведений. Инсерционныймутагенез. В микроцентрифужных пробирках в 40 мкл охлажденного 10%-го глицерина ресуспендировали клетки 18 ч агаровой культуры B. mallei Ц-5 до плотности 1 х 109 м.к./мл, смешивали с 1 мкл стокового раствора EZ::TN5<R6Kyori/KAN-2>Tnp, смесь переносили в охлажденные 1-мм кюветы и проводили электропорацию на приборе MicroPulser™ Electroporator (Bio-Rad) при напряжении в 1,8 kV с 3-кратным импульсом. Далее сразу же в кювету добавляли 1.0 мл N-бульона, ресуспендировали и переносили взвесь в культуральные пробирки для подращивания при 37 °С в течение 24 ч. Затем по 0,1 мл высевали на селективные среды (канамицин 2,5 мкг/мл) и рассчитывали частоту инсерции по соотношению числа выросших клонов на селективных средах к общему числу клеток в инокуляте. У полученных клонов B. mallei Ц-5, несущих транспозонные инсерции, определяли уровень приобретенной резистентности к антибиотику, детерминируемому генами транспозона (канамицин). Биохимическая активность. Активность штаммов в отношении 23 биохимических субстратов исследовали на планшетах Micronault IDS на микробиологическом анализаторе MICROTAX (SY-Lab, Австрия) в соответствии с инструкциями производителя. Масс-спектрометрическое профилирование. Из 18 ч культур буркхольдерий, выросших на L-агаре, готовили взвеси в 300 мкл ультрачистой воды для ВЭЖХ (Pancreac, Испания) в микроцентрифужных пробирках, объемом 1,5 мл. Материал тщательно суспендировали для достижения максимально гомогенизированной взвеси. Затем в пробирки с препаратами добавляли по 900 мкл абсолютного этанола, перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение получаса. После экспозиции центрифугировали 2 минуты при 13000 об ./мин, удаляли супернатант, высушивали на воздухе. Потом в пробирки вносили по 50 мкл 70%-го раствора муравьиной кислоты и ацетонитрила и снова перемешивали. Материал в объеме 1 мкл наносили на лунки мишени. На каждую пробу добавляли по 1 мкл матрицы для MALDI-TOF (а-циано-гидроксикоричная кислота в ра створе 50%-го ацетонитрила и 2,5%-й трифторуксусной кислоты). После кристаллизации проб мишень с образцами помещали в камеру масс-спектрометра Axima Confidence™ (Shimadzu, Япония). Регистрацию масс-спектров осуществляли в диапазоне 1500-12000 m/z, фиксировались только положительные ионы, суммарный спектр каждого образца составлялся на основе 100 единичных импульсов. Все масс-спектры регистрировали в линейном режиме, без использования рефлектрона. Определение цитопатогенности. Уровень цито-патогенного эффекта штаммов определяли с помощью растительной модели P aculeata [3, 4]. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ При электропорационной передаче в штамм B. mallei Ц-5 системы EZ::TN5<R6Kyori/KAN-2>Tnp были получены 8 инсерционных вариантов, резистентных к канамицину. Частота образования мутантов составила n х 10-6. Мутанты B. mallei Ц-5 характеризовались наибольшими изменениями в уровне устойчивости к канамицину и тетрациклину (рис. 1). При этом резистентность к препарату аминогликозидного ряда возросла в несколько раз, а уровень устойчивости к тетрациклину повысился в 2,5 раза у клона № 5 и снизился в 2 раза у вариантов № 6, 7, 8. Устойчивость к хлорамфениколу, офлоксацину и цефоперазону демонстрировала некоторую тенденцию к снижению. Рис. 1. Антибиотикорезистентность инсерционных вариантов B.mallei Ц-5: W.t - B. mallei Ц-5; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 - инсерционные варианты B. mallei Ц-5; CHL - хлорамфеникол, KAN - канамицин, TET - тетрациклин, OFX - офлоксацин, CFZ - цефоперазон Определение питательных потребностей по схеме Холлидея показало, что включение транспозона Tn5 индуцировало у двух клонов (№ 6, 7) мутации зависимости от триптофана и гистидина. Мутант № 2 давал рост при добавлении в минимальную среду глутамата, глутамина, аргинина, пролина, что позволило предположить у него зависимость от их общего предшественника а-оксоглутарата (табл.). Характер роста полученных клонов B. mallei на среде с основным фуксином выявил различия у 6 мутантов по сравнению с диким штаммом, которые снизили резистентность и характеризовались отсутствием роста на этих средах. ■ W.t □ 1 □ 2 □ 3 □ 4 В 5 ■ 6 □ 7 ІШ 8 86 Выпуск 4 (56). 2015 Адсорбция клетками колоний липофильного красителя судана черного объясняется отсутствием продукции экранирующего гидрофильного экзополисахарида [8]. Так, клетки исходного штамма B. mallei Ц-5 не обладали способностью к окрашиванию данным красителем, однако 2 транспозонных варианта (№ 3 и № 5) приобрели такую способность. Фенотипическая характеристика инсерционных вариантов штамма B. mallei Ц-5 Штаммы B. mallei Ц-5 Питательные потребности Рост на среде с фуксином Адсорбция судана черного № 1 прототроф + - № 2 а-оксоглутарат - - № 3 прототроф ++ + № 4 прототроф + - № 5 прототроф ++ + № 6 триптофан - - № 7 гистидин - - № 8 прототроф + - W.t. прототроф ++ - Примечание. «++» - сливной рост колоний, «+»- рост отдельных колоний, «-» - отсутствие роста. В результате проведенного анализа было установлено, что изменения в биохимических свойствах у по лученных мутантов по сравнению с исходным штаммом касались в первую очередь уреазной активности. Так, у трех транспозонных вариантов (№ 1, 3 и 8) способность к утилизации мочевины была утрачена. Следует отметить, что наблюдалось также повышение хитиназной и фосфодиэстеразной активностей у мутантов по сравнению с продукцией этих ферментов у исходного штамма. При сравнительном анализе масс-спектров клеточных белков транспозонных вариантов и исходного штамма B. mallei Ц-5 были выявлены изменения в экспрессии протеинов с молекулярными массами 5203.3, 5243.9, 6560.1, 7578.9, 8155.1 Da. Дендрограмма сходства масс-спектров исследованных штаммов показала, что наиболее близкими по белковым профилям к штамму дикого типа являются мутанты № 6, 7 и 8 (рис. 2). Штаммы, отличающиеся от исходного по белковым профилям, характеризовались измененной цитопатогенностью. Так, дикий штамм B. mallei Ц-5 вызывал почернение и изъязвление листовой пластинки P aculeata по месту надреза с отсутствием мацерации. Повреждения тестового растения инсерционными мутантами B. mallei были менее выраженными и отличались между собой. Варианты № 2, 6 и 7 не обладали цитопатогенным эффектом, а клон № 4 вызывал повреждения листовой пластинки легкой степени (рис. 3). В данном исследовании на модели B. mallei был впервые применен транспозонный комплекс на основе _50_60 % Nr - Tn 6 Рис. 2. Дендрограмма сходства, основанная на масс-спектрах инсерционных вариантов штамма B. mallei Ц-5 B. mallei ^5W.t B. mallei Ц-5 № 4 B. mallei Ц-5 № 2, 6, 7 0 & Рис. 3. Цитопатогенность штаммов B. mallei Ц-5 для растения P. aculeata - Выпуск 4 (56). 2015 87 ЩШгорСз [ЩсмеТКЩ EZ-Tn5TM, содержащий ген устойчивости к канамицину для получения транспозонных мутантов посредством электропорации. Также нами была несколько модифицирована методика электропорационной передачи вектора - бульонная среда для выращивания реципиент-ного штамма была заменена на плотную для исключения этапа центрифугирования и отмывания клеток. Все известные штаммы B. mallei характеризуются чувствительностью к антибиотикам аминогликозидного ряда (гентамицину, канамицину), тетрациклинам (тетрациклину, доксициклину) и устойчивостью к полимикси-нам и пеницилиннам [1, 10]. Инсерционные варианты, полученные в данной работе, характеризовались резистентностью к канамицину, опосредованную генами транспозона Tn5. Снижение устойчивости к хлорамфе-николу, офлоксацину, цефоперазону, тетрациклину у вариантов № 3-7 может быть обусловлено встройкой транспозона в сайт генной последовательности непосредственно детерминант резистентности или контролирующих их экспрессию элементов. Увеличение ре-зистентости к тетрациклину у одного из мутантов (№ 5) может предполагать вовлечение различных механизмов ее формирования благодаря геномным перестройкам из-за инсерции транспозона. Известно, что транспозон Tn5 не является сайт-специфичным и обладает способностью включаться в различные локусы репликонов. Разнообразие полученных фенотипических классов мутантов свидетельствует об эффективной встройке транспозона в регионы различных детерминант биосинтеза и метаболических путей (приобретение ауксотрофности, утрата экспрессии отдельных ферментов, изменение отношения к красителям, изменения в продукции структурных клеточных белков). Известна взаимосвязь повышения антибиотико-резистентности и снижения вирулентности у бактериальных видов, в том числе и у патогенных Burkholderia [2]. В предыдущих исследованиях на модели золотистых хомячков и перитонеальных макрофагов морской свинки in vitro было показано, что инсерция транспозона Tn5 в хромосому сопровождалась снижением вирулентности [1]. Аналогичное снижение вирулентных свойств было выявлено и у инсерционных мутантов B. mallei, полученных электропорацией. Так, варианты № 2, 6 и 7 оказались авирулентными для растительной модели. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, выполненное исследование продемонстрировало возможность использования системы EZ::TN5<R6Kyori/KAN-2>Tnp для эффективного транспозонного мутагенеза штаммов B. mallei с помощью электропорации. Сравнительный анализ выявил преимущества работы с этой системой (простоту и быстрое получение результатов) по сравнению с традиционным методом коньюгационной передачи транспозонов. Дальнейшая работа в данном направлении предполагает разработку систем направленного мутагенеза, создание библиотек мутантных клонов с нокаутированными отдельными генами и выяснение особенностей механизмов их экспрессии.

Об авторах

Елена Владимировна Молчанова

Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Email: elenakalinki@yandex.ru
к. б. н., с. н. с. лаборатории коллекционных штаммов ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, ассистент кафедры молекулярной биологии и генетики Волгоградского государственного медицинского университета

Я. А. Лопастейская

Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Кафедра молекулярной биологии и генетики

Т. Н. Шаров

Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Н. П. Агеева

Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Д. В. Викторов

Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Кафедра молекулярной биологии и генетики

А. В. Топорков

Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека; Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Кафедра молекулярной биологии и генетики

Список литературы

Дополнительные файлы