APPLICATION OF EZ::TN5 < R6KγORI / KAN-2 > TNP KIT TO OBTAIN INSERTIONAL BURKHOLDERIA MALLEI MUTANTS

Full Text

B. mallei является возбудителем тяжелого заболевания человека и животных-сапа и относится ко второй группе патогенности. В настоящее время проведено полное секвенирование геномов отдельных штаммов этого микроорганизма [9], однако завершенная функциональная аннотация генома B. mallei требует дополнительных исследований роли отдельных генетических детерминант. Транспозонный мутагенез широко используется для изучения функций отдельных генов и механизмов клеточных процессов. Традиционные методики инсерционного мутагенеза основывались на конъюгационной передаче в клетки исследуемого вида микроорганизма плазмиды, несущей в своем составе транспозон и последующей элиминации вектора. Таким способом ранее нами были получены инсерционные мутанты B. mallei посредством передачи плазмиды (pSUP5011), несущей транспозон Tn 5, от Escherichia ooli S 17-1 [1]. Недостатками использованного подхода были значительная временная продолжительность экспериментов и необходимость в подборе условий для последующей элиминации суицидного вектора и селективных сред для исключения роста донорного штамма. В настоящее время для высокоэффективного направленного мутагенеза применяются готовые транспозонные конструкции на основе векторов с высокой частотой передачи и встройки. Такие конструкции, в частности, входят в состав коммерческих наборов для in vitro мутагенеза EZ-Tn5™ <R6Kyori/KAN-2(DGFR)>Transposome™Kit (Epicentre, США) и включают рекомбинантный вектор на основе транспозона Tn5 с областью начала репликации R6Kyori E. coli и детерминантами резистентности к канами-цину (<R6Kyori/KAN-2>) или триметоприму (<DGFR>), а также транспозазу EZ-Tn5™ Transposase, обеспечивающую высокую частоту инсерций транспозона в таргетную последовательность при электропорационной передаче и набор секвенационных праймеров для анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК, фланкирующих область инсерции [5, 6, 7]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Оценка эффективности системы EZ::TN5<R6Kyori/ KAN-2>Tnp для получения инсерционных мутантов B. mallei и их первичная фенотипическая характеристика. Выпуск 4 (56). 2015 85 ЩШгорСз [ЩсмеТКЩ МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Бактериальные штаммы. В качестве исходного при получении инсерционных мутантов был использован штамм B. mallei Ц-5 дикого типа. Штамм E. coli CCUG (Culture Collection, University of Goteborg, Швеция) использовался в качестве контрольного при масс-спектрометрическом профилировании бактериальных клеток. Культуры микроорганизмов выращивали на питательном агаре (Nutrient agar, Himedia; L- agar, Difco) и в питательном бульоне (Nutrient broth, Himedia) при температуре 37 °С. Определение уровня антибиотикорезистентно-сти. Минимальные подавляющие концентрации (МПК) офлоксацина, тетрациклина, канамицина, хлорамфени-кола, цефоперазона определяли на агаре Мюллер-Хинтон (Himedia) методом серийных разведений. Инсерционныймутагенез. В микроцентрифужных пробирках в 40 мкл охлажденного 10%-го глицерина ресуспендировали клетки 18 ч агаровой культуры B. mallei Ц-5 до плотности 1 х 109 м.к./мл, смешивали с 1 мкл стокового раствора EZ::TN5<R6Kyori/KAN-2>Tnp, смесь переносили в охлажденные 1-мм кюветы и проводили электропорацию на приборе MicroPulser™ Electroporator (Bio-Rad) при напряжении в 1,8 kV с 3-кратным импульсом. Далее сразу же в кювету добавляли 1.0 мл N-бульона, ресуспендировали и переносили взвесь в культуральные пробирки для подращивания при 37 °С в течение 24 ч. Затем по 0,1 мл высевали на селективные среды (канамицин 2,5 мкг/мл) и рассчитывали частоту инсерции по соотношению числа выросших клонов на селективных средах к общему числу клеток в инокуляте. У полученных клонов B. mallei Ц-5, несущих транспозонные инсерции, определяли уровень приобретенной резистентности к антибиотику, детерминируемому генами транспозона (канамицин). Биохимическая активность. Активность штаммов в отношении 23 биохимических субстратов исследовали на планшетах Micronault IDS на микробиологическом анализаторе MICROTAX (SY-Lab, Австрия) в соответствии с инструкциями производителя. Масс-спектрометрическое профилирование. Из 18 ч культур буркхольдерий, выросших на L-агаре, готовили взвеси в 300 мкл ультрачистой воды для ВЭЖХ (Pancreac, Испания) в микроцентрифужных пробирках, объемом 1,5 мл. Материал тщательно суспендировали для достижения максимально гомогенизированной взвеси. Затем в пробирки с препаратами добавляли по 900 мкл абсолютного этанола, перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение получаса. После экспозиции центрифугировали 2 минуты при 13000 об ./мин, удаляли супернатант, высушивали на воздухе. Потом в пробирки вносили по 50 мкл 70%-го раствора муравьиной кислоты и ацетонитрила и снова перемешивали. Материал в объеме 1 мкл наносили на лунки мишени. На каждую пробу добавляли по 1 мкл матрицы для MALDI-TOF (а-циано-гидроксикоричная кислота в ра створе 50%-го ацетонитрила и 2,5%-й трифторуксусной кислоты). После кристаллизации проб мишень с образцами помещали в камеру масс-спектрометра Axima Confidence™ (Shimadzu, Япония). Регистрацию масс-спектров осуществляли в диапазоне 1500-12000 m/z, фиксировались только положительные ионы, суммарный спектр каждого образца составлялся на основе 100 единичных импульсов. Все масс-спектры регистрировали в линейном режиме, без использования рефлектрона. Определение цитопатогенности. Уровень цито-патогенного эффекта штаммов определяли с помощью растительной модели P aculeata [3, 4]. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ При электропорационной передаче в штамм B. mallei Ц-5 системы EZ::TN5<R6Kyori/KAN-2>Tnp были получены 8 инсерционных вариантов, резистентных к канамицину. Частота образования мутантов составила n х 10-6. Мутанты B. mallei Ц-5 характеризовались наибольшими изменениями в уровне устойчивости к канамицину и тетрациклину (рис. 1). При этом резистентность к препарату аминогликозидного ряда возросла в несколько раз, а уровень устойчивости к тетрациклину повысился в 2,5 раза у клона № 5 и снизился в 2 раза у вариантов № 6, 7, 8. Устойчивость к хлорамфениколу, офлоксацину и цефоперазону демонстрировала некоторую тенденцию к снижению. Рис. 1. Антибиотикорезистентность инсерционных вариантов B.mallei Ц-5: W.t - B. mallei Ц-5; 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 - инсерционные варианты B. mallei Ц-5; CHL - хлорамфеникол, KAN - канамицин, TET - тетрациклин, OFX - офлоксацин, CFZ - цефоперазон Определение питательных потребностей по схеме Холлидея показало, что включение транспозона Tn5 индуцировало у двух клонов (№ 6, 7) мутации зависимости от триптофана и гистидина. Мутант № 2 давал рост при добавлении в минимальную среду глутамата, глутамина, аргинина, пролина, что позволило предположить у него зависимость от их общего предшественника а-оксоглутарата (табл.). Характер роста полученных клонов B. mallei на среде с основным фуксином выявил различия у 6 мутантов по сравнению с диким штаммом, которые снизили резистентность и характеризовались отсутствием роста на этих средах. ■ W.t □ 1 □ 2 □ 3 □ 4 В 5 ■ 6 □ 7 ІШ 8 86 Выпуск 4 (56). 2015 Адсорбция клетками колоний липофильного красителя судана черного объясняется отсутствием продукции экранирующего гидрофильного экзополисахарида [8]. Так, клетки исходного штамма B. mallei Ц-5 не обладали способностью к окрашиванию данным красителем, однако 2 транспозонных варианта (№ 3 и № 5) приобрели такую способность. Фенотипическая характеристика инсерционных вариантов штамма B. mallei Ц-5 Штаммы B. mallei Ц-5 Питательные потребности Рост на среде с фуксином Адсорбция судана черного № 1 прототроф + - № 2 а-оксоглутарат - - № 3 прототроф ++ + № 4 прототроф + - № 5 прототроф ++ + № 6 триптофан - - № 7 гистидин - - № 8 прототроф + - W.t. прототроф ++ - Примечание. «++» - сливной рост колоний, «+»- рост отдельных колоний, «-» - отсутствие роста. В результате проведенного анализа было установлено, что изменения в биохимических свойствах у по лученных мутантов по сравнению с исходным штаммом касались в первую очередь уреазной активности. Так, у трех транспозонных вариантов (№ 1, 3 и 8) способность к утилизации мочевины была утрачена. Следует отметить, что наблюдалось также повышение хитиназной и фосфодиэстеразной активностей у мутантов по сравнению с продукцией этих ферментов у исходного штамма. При сравнительном анализе масс-спектров клеточных белков транспозонных вариантов и исходного штамма B. mallei Ц-5 были выявлены изменения в экспрессии протеинов с молекулярными массами 5203.3, 5243.9, 6560.1, 7578.9, 8155.1 Da. Дендрограмма сходства масс-спектров исследованных штаммов показала, что наиболее близкими по белковым профилям к штамму дикого типа являются мутанты № 6, 7 и 8 (рис. 2). Штаммы, отличающиеся от исходного по белковым профилям, характеризовались измененной цитопатогенностью. Так, дикий штамм B. mallei Ц-5 вызывал почернение и изъязвление листовой пластинки P aculeata по месту надреза с отсутствием мацерации. Повреждения тестового растения инсерционными мутантами B. mallei были менее выраженными и отличались между собой. Варианты № 2, 6 и 7 не обладали цитопатогенным эффектом, а клон № 4 вызывал повреждения листовой пластинки легкой степени (рис. 3). В данном исследовании на модели B. mallei был впервые применен транспозонный комплекс на основе _50_60 % Nr - Tn 6 Рис. 2. Дендрограмма сходства, основанная на масс-спектрах инсерционных вариантов штамма B. mallei Ц-5 B. mallei ^5W.t B. mallei Ц-5 № 4 B. mallei Ц-5 № 2, 6, 7 0 & Рис. 3. Цитопатогенность штаммов B. mallei Ц-5 для растения P. aculeata - Выпуск 4 (56). 2015 87 ЩШгорСз [ЩсмеТКЩ EZ-Tn5TM, содержащий ген устойчивости к канамицину для получения транспозонных мутантов посредством электропорации. Также нами была несколько модифицирована методика электропорационной передачи вектора - бульонная среда для выращивания реципиент-ного штамма была заменена на плотную для исключения этапа центрифугирования и отмывания клеток. Все известные штаммы B. mallei характеризуются чувствительностью к антибиотикам аминогликозидного ряда (гентамицину, канамицину), тетрациклинам (тетрациклину, доксициклину) и устойчивостью к полимикси-нам и пеницилиннам [1, 10]. Инсерционные варианты, полученные в данной работе, характеризовались резистентностью к канамицину, опосредованную генами транспозона Tn5. Снижение устойчивости к хлорамфе-николу, офлоксацину, цефоперазону, тетрациклину у вариантов № 3-7 может быть обусловлено встройкой транспозона в сайт генной последовательности непосредственно детерминант резистентности или контролирующих их экспрессию элементов. Увеличение ре-зистентости к тетрациклину у одного из мутантов (№ 5) может предполагать вовлечение различных механизмов ее формирования благодаря геномным перестройкам из-за инсерции транспозона. Известно, что транспозон Tn5 не является сайт-специфичным и обладает способностью включаться в различные локусы репликонов. Разнообразие полученных фенотипических классов мутантов свидетельствует об эффективной встройке транспозона в регионы различных детерминант биосинтеза и метаболических путей (приобретение ауксотрофности, утрата экспрессии отдельных ферментов, изменение отношения к красителям, изменения в продукции структурных клеточных белков). Известна взаимосвязь повышения антибиотико-резистентности и снижения вирулентности у бактериальных видов, в том числе и у патогенных Burkholderia [2]. В предыдущих исследованиях на модели золотистых хомячков и перитонеальных макрофагов морской свинки in vitro было показано, что инсерция транспозона Tn5 в хромосому сопровождалась снижением вирулентности [1]. Аналогичное снижение вирулентных свойств было выявлено и у инсерционных мутантов B. mallei, полученных электропорацией. Так, варианты № 2, 6 и 7 оказались авирулентными для растительной модели. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, выполненное исследование продемонстрировало возможность использования системы EZ::TN5<R6Kyori/KAN-2>Tnp для эффективного транспозонного мутагенеза штаммов B. mallei с помощью электропорации. Сравнительный анализ выявил преимущества работы с этой системой (простоту и быстрое получение результатов) по сравнению с традиционным методом коньюгационной передачи транспозонов. Дальнейшая работа в данном направлении предполагает разработку систем направленного мутагенеза, создание библиотек мутантных клонов с нокаутированными отдельными генами и выяснение особенностей механизмов их экспрессии.

About the authors

E. V. Molchanova

FSHI «Volgograd Scientific Research Plague Control Institute» of Federal Supervision Agency for Customer Protection and Human Welfare; SFEE HPE «Volgograd State Medical University» of the Ministry of Public Health of the Russian Federation

Email: elenakalinki@yandex.ru

J. A. Lopasteyskaya

FSHI «Volgograd Scientific Research Plague Control Institute» of Federal Supervision Agency for Customer Protection and Human Welfare; SFEE HPE «Volgograd State Medical University» of the Ministry of Public Health of the Russian Federation

T. N. Sharov

FSHI «Volgograd Scientific Research Plague Control Institute» of Federal Supervision Agency for Customer Protection and Human Welfare

N. P. Ageeva

FSHI «Volgograd Scientific Research Plague Control Institute» of Federal Supervision Agency for Customer Protection and Human Welfare

D. V. Viktorov

FSHI «Volgograd Scientific Research Plague Control Institute» of Federal Supervision Agency for Customer Protection and Human Welfare; SFEE HPE «Volgograd State Medical University» of the Ministry of Public Health of the Russian Federation

A. V. Toporkov

FSHI «Volgograd Scientific Research Plague Control Institute» of Federal Supervision Agency for Customer Protection and Human Welfare; SFEE HPE «Volgograd State Medical University» of the Ministry of Public Health of the Russian Federation

References

Supplementary files