ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДИКИ МЕДЬ-ЗАВИСИМОГО АУТООКИСЛЕНИЯ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ. АНАЛИЗ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ С ПРИМЕНЕНИЕМ ИНТЕГРАЛЬНЫХ ВЫЧИСЛЕНИЙ
- Авторы: Иванов А.В1, Шамшина Д.Д1, Литвинов Р.А.1, Батраков В.В1
-
Учреждения:
- ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» МЗ РФ
- Выпуск: Том 15, № 2 (2018)
- Страницы: 47-49
- Раздел: Статьи
- URL: https://journals.eco-vector.com/1994-9480/article/view/119248
- DOI: https://doi.org/10.19163/1994-9480-2018-2(66)-47-49
- ID: 119248
Цитировать
Полный текст
Аннотация
В данном исследовании описана оптимизация методики медь-индуцированного аутоокисления аскорбиновой кислоты как способа оценки хелатирующей активности веществ на примере пиоглитазона. В процесс регистрации данных была внедрена техника real-time. Анализ данных проведен с применением интегральных исчислений и последующей кластеризацией данных. Это позволило вести более быстрое определение активности и использовать в сравнительном анализе одну концентрацию в противовес стандартному концентрационному исследованию.
Полный текст
Ascorbate, multifunctional autoxidation, chelation, copper sulfate (II), real-time analysis. Биогенные металлы (Cu2+, Fe2+, Fe3+, Zn2+ и другие, относимые к металлам с переменной валентностью) вовлечены в патогенез сосудистых и неврологических осложнений диабета (микро- и макроангиопа-тия, нефропатия, ретинопатия, энцефалопатия, полинейропатия), а также участвуют в развитии некоторых нейродегенеративных и сердечно-сосудистых патологий [2, 3, 5-7]. Образование поперечно-сшитых белков, как конечного звена патогенеза, активно протекает в условиях длительной гипергликемии (глики-рование аминокислотных остатков => основания Шиф-фа => продукты Амадори => реакция Суйяма или На-мики или Ходжа => образование аминоадипата => сшивание), однако может проходить в условиях нормального уровня глюкозы, на фоне усиления процессов оксидативной деградации аминокислот (реакции перекисного окисления => путь Штадтмана => образование аминоадипата => сшивание) [9]. Данные реакции активнее протекают в условиях нарушенного гомеостаза металлов переменной валентности и при увеличении образования металлами АФК. Это позволяет рассматривать биогенные металлы переходного ряда как актуальную мишень в разработке средств фармакотерапии осложнений диабета. Роль металлов в представленном метаболоме заключена в нуклеофильном катализе и ускоренном образовании АФК, а потому не только хелация, но и изменение энергии d-орбитали и инактивация АФК являются способами устранения их нежелательной активности. В литературе [4] представ лено обозначение подобной активности термином «многофункциональная антиоксидантность, сочетающаяся схелацией». Аскорбиновая кислота в присутствии Cu2+, Fe2+, Fe3+ и др. вступает в реакцию аутоокисления, этапами которой также являются нуклеофильный катализ окисления и окисление от воздействия образующихся АФК [8]. Вещества, тормозящие реакцию металл-индуцирован-ного аутоокисления, могут рассматриваться как потенциальные многофункциональные антиоксиданты с хелатирующей активностью. Скорость окисления аскорбиновой кислоты определена кинетикой окисления, которое напрямую зависит от уровня проявляемой веществом активности. Данная зависимость позволяет оценить активность вещества без прибегания к стандартному определению показателя полуактивной концентрации в пользу исследования в одной концентрации. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Оптимизация методики медь-индуцированного аутоокисления аскорбиновой кислоты путем внедрения процедуры real-time в процесс регистрации данных. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Объект определения: Пиоглитазона гидрохлорид. Реактивы: Аскорбиновая кислота (х.ч), сульфат меди (II) пятиводный (х.ч.) деионизированная вода (деионизатор Prodeion 10 VS). Выпуск 2 (66). 2018 47 ІШторСз Стандартная операционная процедура: оригинальная методика медь-индуцированного аутоокисления аскорбиновой кислоты предварительно настроена, вали-дизирована [1] и неоднократно использована коллективом авторов в исследовательской деятельности [10, 11]. Для стандартного теста готовили раствор индикатора - 100 мкМ аскорбиновой кислоты в деионизированной воде. Перед проведением реакции в кварцевую кювету (V = 3 мл, l = 10 мм), установленную в спектрофотометре APEL PD 303 UV (Япония), вносили 2,5 мл 100 мкМ раствора аскорбиновой кислоты. Целевая оптическая плотность данного раствора, готового к инициации реакции аутоокисления, при рабочей длине волны X 265 нм составляла 1250 ± 50 (измерение против деионизированной воды, для удобства все значения оптической плотности умножены на 1000). Пиогли-тазон растворяли в 1 мл ДМСО 99%. Индуктор аутоокисления - сульфат меди (II) пятиводный - растворяли в деионизированной воде. 75 мкМ маточного раствора пиоглитазона инкубировали при 37 оС вместе с 150 мкМ раствора индуктора аутоокисления (эквивалентно 95 мкМ безводной соли). После проведения инкубации, смесь вносили в кювету с аскорбиновой кислотой, фиксировали падение оптической плотности при длине волны X 265 нм с временным интервалом 5 секунд после начала реакции, и до полной ее остановки. Анализ активности проводили методом оценки интегральных величин (определенный интеграл) с последующей кластеризацией полученных данных. Построенные графики зависимости оптической плотности от времени проанализировали через расчет интеграла линейной функции нескольких переменных. Функция оправдана наличием линейной зависимости между графическими отображениями оптической плотности и ходом времени в интегральном построении. Условия проведения интегрального анализа: шаг точности (Е) = 1, диапазон значений (коэффициент Х*Е) от -2 до 260. К определению интеграла использовали метод Риманна. Статистическая обработка была проведена методом кластеризации к-средних в программе STATISTICA 12 (версия 12.5.192.7) с целью оценки уровня значимости для полученных классов: 1) экспериментальные и 2) контрольные данные, с последующим выявлением значимости различий. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В результате проведения экспериментов получили графики падения оптической плотности аскорбиновой кислоты во времени (рис. 1). Представленные графические зависимости доступны для сравнительного анализа различными методами в реальном времени, например, для определения так называемой точки полуреакции T1/2. Аутоокисление аскорбиновой кислоты является реакцией Жабо-тинского - колебательным процессом. Поэтому из-за наличия колебаний, нативные графики неудобны для анализа real-time с опорой на свойства кривых. При подборе способа анализа активности веществ по кривым наиболее пригодным является нахождение интегральной функции и значений определенного интеграла. Интеграл представляет собой сумму простых функций и используется для нахождения площади фигуры под кривой обобщенной функции. При анализе каждый отдельный график кривых падения оптической плотности (n = 5 для опытной и контрольной групп) описывали с помощью значения интеграла нескольких линейных функций: Y= A + BX1 + CX + DX + EX4 + FX5; где X1-5 - значения падения оптической плотности, A-F - коэффициенты регрессии, равные 256,27; 1,48; 0,34; -1,99; 0,07; -0.17 соответственно. Применение данных функций оправданно наличием зависимости между графическим отображением оптической плотности и ходом времени. Условия для проведения интегрального анализа следующие: шаг точности (E) = 1, диапазон значений (коэффициент X*E) от -2 до 260. Полученные методом Риманна данные контрольных (593,02) и экспериментальных (270,65) значений являются признаком наличия прямой зависимости в паттерне падения оптической плотности, что служит признаком чувствительности методики к иско А Б Рис. 1. Зависимость падения оптической плотности аскорбиновой кислоты при добавлении смеси 150 мкМ сульфата меди (II) пятиводного и ДМСО (А) и смеси 150 мкМ сульфата меди (II) пятиводного с 75 мкМ пиоглитазона, растворенного в ДМСО (Б) 48 Выпуск 2 (66). 2018 üssmpfä [ЩшігїГ ШШ мой активности. Кластерные группы разделены значительным эвклидовым расстоянием, позволяющим идентифицировать различия между ними. Экспериментальные значения: 0,261, контрольные значения: 0,068. Уровень значимости различий Р. < 0,001. Таким образом, значения определенного интеграла кривых оптической плотности являются чувствительным фактором присутствия искомой активности. Кластеризация результатов, в свою очередь, является способом определения значимости различий. Время,с Рис 2. Коридор между значениями определенного интеграла контроля и опыта ЗАКЛЮЧЕНИЕ Методика медь-индуцированного аутоокисления аскорбиновой кислоты оптимизирована на примере исследования пиоглитазона. При регистрации информации использована техника real-time с пошаговой фиксацией динамики оптической плотности во времени. Сравнительная оценка дана посредством кластеризации значений определенного интеграла, полученного по методу Риман-на. Отмечена высокая чувствительность оптимизированной методики к наличию активности. ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES×
Об авторах
А. В Иванов
ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» МЗ РФ
Д. Д Шамшина
ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» МЗ РФ
Роман Александрович Литвинов
ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» МЗ РФ
Email: litvinov.volggmu@mail.ru
к. м. н., ассистент кафедры фармакологии
В. В Батраков
ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» МЗ РФ
Список литературы
- Шамшина Д.Д., Литвинов РА. [SHamshina D.D., Litvinov R.A.] Валидация методики медь-зависимого аутоокисления аскорбиновой кислоты как способа оценки активности соединений, связывающих d-элементы [Validaciya metodiki med'-zavisimogo autookisleniya askorbinovoj kisloty kak sposoba ocenki aktivnosti soedinenij, svyazyvayushchih d-ehlementy] [Validation of the procedure of copper-dependent autooxidation of ascorbic acid as a way of assessing the activity of compounds linking d-elements]. Вестник ВолгГМУ [Vestnik VolgGMU] [Bulletin of VolgGMU], 2018, no. 1 (65), pp. 115-117. (In Russ.; abstr. in Engl.).
- Aneni E.C., Escolar E., Lamas G.A. Chronic Toxic Metal Exposure and Cardiovascular Disease: Mechanisms of Risk and Emerging Role of Chelation Therapy. Curr. Atheroscler. Rep., 2016, Vol. 18 (12), pp. 81.
- Dusek P, Schneider S.A., Aaseth J. Iron chelation in the treatment of neurodegenerative diseases. J. Trace Elem. Med. Bio., 2016, Vol. 38, pp. 81-92.
- Kawada H., Kador P.F. Orally Bioavailable Metal Chelators and Radical Scavengers: Multifunctional Antioxidants for the Coadjutant Treatment of Neurodegenerative Diseases. J. Med. Chem., 2015, Vol. 58 (22), pp. 8796-8805.
- Khan A.R., Awan F.R. Metals in the pathogenesis of type 2 diabetes. J. Diabetes Metab. Disord., 2014, Vol. 13, pp. 16.
- Lamas G.A., Navas-Acien A., Mark D.B., Lee K.L. Heavy Metals, Cardiovascular Disease, and the Unexpected Benefits of Chelation Therapy. JACC, 2016, Vol. 67 (20), pp. 2411-2418.
- Nagai R., Murray D.B., Metz T.O., Baynes J.W. Chelation: a fundamental mechanism of action of AGE inhibitors, AGE breakers, and other inhibitors of diabetes complications. Diabetes, 2012, Vol. 61 (3), pp. 549-559.
- Price D.L., Rhett P.M., Thorpe S.R., Baynes J.W. Chelating activity of advanced glycation end-product inhibitors. J. Biol. Chem., 2001, Vol. 276 (52), pp. 4896748972.
- Sell D.R., Strauch C.M., Shen W., Monnier V. 2-aminoadipic acid is a marker of protein carbonyl oxidation in the aging human skin: effects of diabetes, renal failure and sepsis. Biochem. J., 2007, Vol. 404, pp. 269-277.
- Spasov A.A., Babkov D.A., Sysoeva V.A., et al. 6-nitroazolo[1,5-a]pyrimidin-7(4h)-ones as antidiabetic agents. Archiv der Pharmazie, 2017, Vol. 350 (12).
- Spasov A.A., Zhukovskaya O.N., Brigadirova A.A. et al. Synthesis and pharmacological activity of 2(biphenyl4yl)imidazo [1,2a] benzimidazoles. Russian Chemical Bulletin, 2017, Vol. 66, pp. 1905-1912.