OPTIMISATION OF COPPER-INDUCED ASCORBATE AUTOXIDATION METHOD USING REAL-TIME DETECTION. INTEGRATIVE DECISION EXAMPLE


Cite item

Full Text

Abstract

This paper describes the new approach of process of optimization and comprehended analysis of results for copper-induced ascorbate autoxidation method. This is a metod of chelating activity detection. Real-time technique in data registration was used and integrative analysis in comparison of the results was applied. It gived a possible to evaluate the chelation properties of pioglitazone without calculation of IC50. This variant is most acual for spread screening of chelating activity.

Full Text

Ascorbate, multifunctional autoxidation, chelation, copper sulfate (II), real-time analysis. Биогенные металлы (Cu2+, Fe2+, Fe3+, Zn2+ и другие, относимые к металлам с переменной валентностью) вовлечены в патогенез сосудистых и неврологических осложнений диабета (микро- и макроангиопа-тия, нефропатия, ретинопатия, энцефалопатия, полинейропатия), а также участвуют в развитии некоторых нейродегенеративных и сердечно-сосудистых патологий [2, 3, 5-7]. Образование поперечно-сшитых белков, как конечного звена патогенеза, активно протекает в условиях длительной гипергликемии (глики-рование аминокислотных остатков => основания Шиф-фа => продукты Амадори => реакция Суйяма или На-мики или Ходжа => образование аминоадипата => сшивание), однако может проходить в условиях нормального уровня глюкозы, на фоне усиления процессов оксидативной деградации аминокислот (реакции перекисного окисления => путь Штадтмана => образование аминоадипата => сшивание) [9]. Данные реакции активнее протекают в условиях нарушенного гомеостаза металлов переменной валентности и при увеличении образования металлами АФК. Это позволяет рассматривать биогенные металлы переходного ряда как актуальную мишень в разработке средств фармакотерапии осложнений диабета. Роль металлов в представленном метаболоме заключена в нуклеофильном катализе и ускоренном образовании АФК, а потому не только хелация, но и изменение энергии d-орбитали и инактивация АФК являются способами устранения их нежелательной активности. В литературе [4] представ лено обозначение подобной активности термином «многофункциональная антиоксидантность, сочетающаяся схелацией». Аскорбиновая кислота в присутствии Cu2+, Fe2+, Fe3+ и др. вступает в реакцию аутоокисления, этапами которой также являются нуклеофильный катализ окисления и окисление от воздействия образующихся АФК [8]. Вещества, тормозящие реакцию металл-индуцирован-ного аутоокисления, могут рассматриваться как потенциальные многофункциональные антиоксиданты с хелатирующей активностью. Скорость окисления аскорбиновой кислоты определена кинетикой окисления, которое напрямую зависит от уровня проявляемой веществом активности. Данная зависимость позволяет оценить активность вещества без прибегания к стандартному определению показателя полуактивной концентрации в пользу исследования в одной концентрации. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Оптимизация методики медь-индуцированного аутоокисления аскорбиновой кислоты путем внедрения процедуры real-time в процесс регистрации данных. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Объект определения: Пиоглитазона гидрохлорид. Реактивы: Аскорбиновая кислота (х.ч), сульфат меди (II) пятиводный (х.ч.) деионизированная вода (деионизатор Prodeion 10 VS). Выпуск 2 (66). 2018 47 ІШторСз Стандартная операционная процедура: оригинальная методика медь-индуцированного аутоокисления аскорбиновой кислоты предварительно настроена, вали-дизирована [1] и неоднократно использована коллективом авторов в исследовательской деятельности [10, 11]. Для стандартного теста готовили раствор индикатора - 100 мкМ аскорбиновой кислоты в деионизированной воде. Перед проведением реакции в кварцевую кювету (V = 3 мл, l = 10 мм), установленную в спектрофотометре APEL PD 303 UV (Япония), вносили 2,5 мл 100 мкМ раствора аскорбиновой кислоты. Целевая оптическая плотность данного раствора, готового к инициации реакции аутоокисления, при рабочей длине волны X 265 нм составляла 1250 ± 50 (измерение против деионизированной воды, для удобства все значения оптической плотности умножены на 1000). Пиогли-тазон растворяли в 1 мл ДМСО 99%. Индуктор аутоокисления - сульфат меди (II) пятиводный - растворяли в деионизированной воде. 75 мкМ маточного раствора пиоглитазона инкубировали при 37 оС вместе с 150 мкМ раствора индуктора аутоокисления (эквивалентно 95 мкМ безводной соли). После проведения инкубации, смесь вносили в кювету с аскорбиновой кислотой, фиксировали падение оптической плотности при длине волны X 265 нм с временным интервалом 5 секунд после начала реакции, и до полной ее остановки. Анализ активности проводили методом оценки интегральных величин (определенный интеграл) с последующей кластеризацией полученных данных. Построенные графики зависимости оптической плотности от времени проанализировали через расчет интеграла линейной функции нескольких переменных. Функция оправдана наличием линейной зависимости между графическими отображениями оптической плотности и ходом времени в интегральном построении. Условия проведения интегрального анализа: шаг точности (Е) = 1, диапазон значений (коэффициент Х*Е) от -2 до 260. К определению интеграла использовали метод Риманна. Статистическая обработка была проведена методом кластеризации к-средних в программе STATISTICA 12 (версия 12.5.192.7) с целью оценки уровня значимости для полученных классов: 1) экспериментальные и 2) контрольные данные, с последующим выявлением значимости различий. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ В результате проведения экспериментов получили графики падения оптической плотности аскорбиновой кислоты во времени (рис. 1). Представленные графические зависимости доступны для сравнительного анализа различными методами в реальном времени, например, для определения так называемой точки полуреакции T1/2. Аутоокисление аскорбиновой кислоты является реакцией Жабо-тинского - колебательным процессом. Поэтому из-за наличия колебаний, нативные графики неудобны для анализа real-time с опорой на свойства кривых. При подборе способа анализа активности веществ по кривым наиболее пригодным является нахождение интегральной функции и значений определенного интеграла. Интеграл представляет собой сумму простых функций и используется для нахождения площади фигуры под кривой обобщенной функции. При анализе каждый отдельный график кривых падения оптической плотности (n = 5 для опытной и контрольной групп) описывали с помощью значения интеграла нескольких линейных функций: Y= A + BX1 + CX + DX + EX4 + FX5; где X1-5 - значения падения оптической плотности, A-F - коэффициенты регрессии, равные 256,27; 1,48; 0,34; -1,99; 0,07; -0.17 соответственно. Применение данных функций оправданно наличием зависимости между графическим отображением оптической плотности и ходом времени. Условия для проведения интегрального анализа следующие: шаг точности (E) = 1, диапазон значений (коэффициент X*E) от -2 до 260. Полученные методом Риманна данные контрольных (593,02) и экспериментальных (270,65) значений являются признаком наличия прямой зависимости в паттерне падения оптической плотности, что служит признаком чувствительности методики к иско А Б Рис. 1. Зависимость падения оптической плотности аскорбиновой кислоты при добавлении смеси 150 мкМ сульфата меди (II) пятиводного и ДМСО (А) и смеси 150 мкМ сульфата меди (II) пятиводного с 75 мкМ пиоглитазона, растворенного в ДМСО (Б) 48 Выпуск 2 (66). 2018 üssmpfä [ЩшігїГ ШШ мой активности. Кластерные группы разделены значительным эвклидовым расстоянием, позволяющим идентифицировать различия между ними. Экспериментальные значения: 0,261, контрольные значения: 0,068. Уровень значимости различий Р. < 0,001. Таким образом, значения определенного интеграла кривых оптической плотности являются чувствительным фактором присутствия искомой активности. Кластеризация результатов, в свою очередь, является способом определения значимости различий. Время,с Рис 2. Коридор между значениями определенного интеграла контроля и опыта ЗАКЛЮЧЕНИЕ Методика медь-индуцированного аутоокисления аскорбиновой кислоты оптимизирована на примере исследования пиоглитазона. При регистрации информации использована техника real-time с пошаговой фиксацией динамики оптической плотности во времени. Сравнительная оценка дана посредством кластеризации значений определенного интеграла, полученного по методу Риман-на. Отмечена высокая чувствительность оптимизированной методики к наличию активности. ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
×

About the authors

A. A Ivanov

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

D. D Shamshina

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

R. A Litvinov

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

Email: litvinov.volggmu@mail.ru

V. V Batrakov

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of Public Health Ministry of the Russian Federation

References

  1. Шамшина Д.Д., Литвинов РА. [SHamshina D.D., Litvinov R.A.] Валидация методики медь-зависимого аутоокисления аскорбиновой кислоты как способа оценки активности соединений, связывающих d-элементы [Validaciya metodiki med'-zavisimogo autookisleniya askorbinovoj kisloty kak sposoba ocenki aktivnosti soedinenij, svyazyvayushchih d-ehlementy] [Validation of the procedure of copper-dependent autooxidation of ascorbic acid as a way of assessing the activity of compounds linking d-elements]. Вестник ВолгГМУ [Vestnik VolgGMU] [Bulletin of VolgGMU], 2018, no. 1 (65), pp. 115-117. (In Russ.; abstr. in Engl.).
  2. Aneni E.C., Escolar E., Lamas G.A. Chronic Toxic Metal Exposure and Cardiovascular Disease: Mechanisms of Risk and Emerging Role of Chelation Therapy. Curr. Atheroscler. Rep., 2016, Vol. 18 (12), pp. 81.
  3. Dusek P, Schneider S.A., Aaseth J. Iron chelation in the treatment of neurodegenerative diseases. J. Trace Elem. Med. Bio., 2016, Vol. 38, pp. 81-92.
  4. Kawada H., Kador P.F. Orally Bioavailable Metal Chelators and Radical Scavengers: Multifunctional Antioxidants for the Coadjutant Treatment of Neurodegenerative Diseases. J. Med. Chem., 2015, Vol. 58 (22), pp. 8796-8805.
  5. Khan A.R., Awan F.R. Metals in the pathogenesis of type 2 diabetes. J. Diabetes Metab. Disord., 2014, Vol. 13, pp. 16.
  6. Lamas G.A., Navas-Acien A., Mark D.B., Lee K.L. Heavy Metals, Cardiovascular Disease, and the Unexpected Benefits of Chelation Therapy. JACC, 2016, Vol. 67 (20), pp. 2411-2418.
  7. Nagai R., Murray D.B., Metz T.O., Baynes J.W. Chelation: a fundamental mechanism of action of AGE inhibitors, AGE breakers, and other inhibitors of diabetes complications. Diabetes, 2012, Vol. 61 (3), pp. 549-559.
  8. Price D.L., Rhett P.M., Thorpe S.R., Baynes J.W. Chelating activity of advanced glycation end-product inhibitors. J. Biol. Chem., 2001, Vol. 276 (52), pp. 4896748972.
  9. Sell D.R., Strauch C.M., Shen W., Monnier V. 2-aminoadipic acid is a marker of protein carbonyl oxidation in the aging human skin: effects of diabetes, renal failure and sepsis. Biochem. J., 2007, Vol. 404, pp. 269-277.
  10. Spasov A.A., Babkov D.A., Sysoeva V.A., et al. 6-nitroazolo[1,5-a]pyrimidin-7(4h)-ones as antidiabetic agents. Archiv der Pharmazie, 2017, Vol. 350 (12).
  11. Spasov A.A., Zhukovskaya O.N., Brigadirova A.A. et al. Synthesis and pharmacological activity of 2(biphenyl4yl)imidazo [1,2a] benzimidazoles. Russian Chemical Bulletin, 2017, Vol. 66, pp. 1905-1912.

Supplementary files

Supplementary Files
Action
1. JATS XML
Download

Copyright (c) 2018 Ivanov A.A., Shamshina D.D., Litvinov R.A., Batrakov V.V.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
СМИ зарегистрировано Федеральной службой по надзору в сфере связи, информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор).
Регистрационный номер и дата принятия решения о регистрации СМИ: серия ПИ № ФС 77 - 79562 от 27.11.2020 г.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies