ЦИТОТОКСИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НОВЫХ АЗОЛОАЗИНОВ ПРИ ИЗУЧЕНИИ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА MCF-7

Полный текст

Во всем мире в 2020 году было диагностировано 19,3 млн новых случаев рака, и это привело к смерти 9,9 млн человек [1]. Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее часто диагностируемым раком у женщин. В 2020 г. заболевание диагностировали у 2,3 млн человек (каждый восьмой новый случай злокачественной опухоли в мире), 685 тысяч от него скончались [2]. РМЖ составляет 23 % от общего числа случаев онкологических заболеваний и 14 % смертей от рака, что делает чрезвычайно актуальными научные исследования в этой области для преодоления как экономических, так и социальных проблем в современном обществе [3]. Общая смертность снизилась лишь на 30 % с чувствительностью >90 % современных подходов к скринингу РМЖ [4]. Несмотря на то, что для лечения рака используется множество подходов, включая хирургические и лучевые, химиотерапия активно используется на всех стадиях лечения РМЖ, в том числе в составе комбинированных схем. Для метастатического рака химио -терапия становится методом выбора [5]. Клеточные линии, по-видимому, являются ключевым элементом для молекулярной диагностики РМЖ, поскольку они могут широко использоваться во многих аспектах изучения РМЖ и повышения эффективности различных подходов к его лечению [6]. Клеточная линия MCF-7, по общему признанию, является универсальным вариантом для скрининговых исследований новых противоопухолевых веществ с самым различным спектром действия [5]. Перспективными и эффективными средствами могут оказаться химические вещества, являющиеся близкими структурными аналогами митозоломида и темозоломида. Последние являются алкилирующими агентами и широко применяются в химиотерапии опухолей. К настоящему моменту синтезированы разнообразные производные темозоломида, представляющие интерес для оценки их применения в качестве противоопухолевых средств [7, 8]. Представляется перспективным провести скрининговую оценку потенциальной цитотоксической активности in vitro для группы соединений рассматриваемого класса производных азолоазинов. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Для скрининга потенциальных противоопухолевых агентов изучить цитотоксические свойства 11 производных азолоазинов в культуре клеток рака молочной железы человека MCF-7. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ В настоящей работе для оценки потенциальных противоопухолевых свойств были использованы следующие вещества (рис. 1). Препаратом сравнения являлся эпирубицин. Субстанция 1 Субстанция 2 Субстанция 3 Этиловый эфир 3-н-пропил-4-оксоимидазо[5,1^ [1, 2, 3, 5]тетразин-8-карбоновой Этиловый эфир 3-циклогексил-4-оксоимидазо[5,1^ [1, 2, 3, 5]тетразин-8-карбоновой 3 -н-Пропил-4-оксоимидазо[5,1^ [1, 2, 3, 5]тетразин-8-М-пиперидинилкарбоксамид Рис. 1. Общая характеристика тестируемых веществ. Синтез производных 1-4 приведен в работе [8], производного 5 - в работе [9], производных 6-9 - в статье [10], производных 10-11 - в статье [11] Субстанция 4 Субстанция 5 Субстанция 6 3-Циклогексил- 4-оксоимидазо[5,1^- [1, 2, 3, 5]тетразин-8-Мпиперидинил-карбоксамид 5 -(/7-Т олуил) -8-этоксикарбонил -иминопиразоло^Д-d] [1, 2, 3, 5]тиатриазин Диэтиловый эфир 4-аминоимидазо[5,1-с] [1, 2, 4]триазин-3,8-дикарбоновой кислоты Субстанция 7 Субстанция 8 Субстанция 9 4-Амино-8-этоксикарбонилимидазо[5,1-с][1, 2, 4]триазин- 3-№циклогексил-карбоксамид 4-Амино-8-этоксикарбонилимидазо[5,1-с][1, 2, 4]триазин- 3-№бензилкарбоксамид 4-Амино-8-этоксикарбонилимидазо[5,1-с][1, 2, 4]триазин- 3-М-(п-толуил)карбоксамид Субстанция 10 Субстанция 11 3-(3'-Фенил-4'-метоксикарбонил-изоксазолил)- Т-фенилпиразоло^Д-^^ДД^риазин 3-(3'-Фенил-4'-метоксикарбонил-изоксазолил)- 7-(п-толил)пиразоло[5,1-c][1, 2, 4]триазин Рис. 1 (окончание). Общая характеристика тестируемых веществ. Синтез производных 1-4 приведен в работе [8], производного 5 - в работе [9], производных 6-9 - в статье [10], производных 10-11 - в статье [11] MCF-7 использована в работе как основная клеточная линия РМЖ человека. В настоящее время MCF-7 является самой популярной линией для исследования цитотоксичности противоопухолевых соединений и молекулярных особенностей протекания рака молочной железы. Клетки имеют эпителио-подобное строение, экспрессируют рецепторы к эстрогенам, могут синтезировать эстрадиол, что делает их оптимальными мишенями для изучения рецепторов и химиотерапии. Линия MCF-7 образует монослойные культуры с выживаемостью до 95 % и конфлюэнт-ностью до 100 % за счет сохранения способности к размножению [12, 13]. Для определения цитотоксичности вначале клеточную культуру MCF-7 рассевали во флакон и доращивали до монослоя. Для пересева на 96-луночный планшет удаляли питательную среду и переводили клетки в раствор дезинтегратора трипсин-ЭДТА 0,25 %, после чего центрифугировали 5 мин при 1000 об./мин. Осадок ресуспензировали в 2 мл полной питательной среды и готовили суспензию из расчета 1 млн клеток в 10 мл полной питательной среды. В каждую лунку планшета помещали 100 мкл суспензии (104 клеток) и добавляли исследуемые вещества в необходи-мых конечных концентрациях - 0,25; 1,0; 2,5; 5,0 и 10,0 мкмоль/л. Помимо этого, на планшете были отрицательный контроль, растворитель 1 % ДМСО и положительный контроль (10 % ДМСО). Планшет с внесенными соединениями помещали на 1 ч в СО2-инкубатор. Для выявления жизнеспособности клеток использовали метилтетразолиевый тест. 100 мг тетра-золиевого красителя растворяли в 40 мл физиологического раствора (5 мг/мл) [14]. Для окрашивания клеток планшет помещали в инкубатор на 2 ч, после чего растворы в лунках заменяли на ДМСО для растворения кристаллов формазана. Выживаемость клеток рассчитывали по формуле (ОП опытных лунок -ОП среды) / (ОП контрольных лунок - ОП среды) * 100 %, где ОП - оптическая плотность. Определяли концентрацию тестируемого соединения, при которой наступало максимальное подавление жизнеспособности клеток от контроля. Концентрацию вещества, которая вызывает 50%-ю гибель клеток (IC50), рассчитывали графически по дозозависимой кривой с помощью программного обеспечения Origin (OriginLabCorporation). Статистическую оценку результатов эксперимента in vitro проводили по каждой клеточной линии путем сравнения показателей в опытной и контрольной группах. Внутригрупповой сравнительный анализ проводился по критерию Краскела - Уоллиса JOURNAL OF VOLGOGRAD STATE j MEDICAL UNIVERSITY (непараметрический вариант ANOVA) с последующими множественными сравнениями по Бонферрони -Данну (пакет Statistica 10.0). Сравнение между группами проводилось по критерию Манна - Уитни. Различия считались статистически значимыми при уровне доверительной вероятности p меньше 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Полученные кривые цитотоксичности тестируемых соединений представлены на рис. 2 и 3. Вначале был проведен анализ цитотоксичности эпирубицина в МТТ-тесте как препарата сравнения. Максимальное подавление Ск/Сmax составило 1,72/0,82 = 2,10. Расчетная концентрация половинного торможения IC50 оказалась равной 9,37 мкмоль/л. Как итог, прямой эффект эпирубицина был расценен как незначительный. Выраженный цитотоксический эффект рубоми-цина, таким образом, приходился только на его максимальную концентрацию. Эти и последующие дозы не сопоставимы с теми, что применяются в практике при лечении злокачественных новообразований. Связано это с тем, что вещество имеет преимущественно цитостатическую активность через воздействие на генетический материал клетки, не затрагивая мембрану, что и являлось бы признаком прямой ц итотоксичности [15]. Б ыло выявлено, что субстанция 1 снижает жизнеспособность клеток РМЖ во всем диапазоне исследованных концентраций с эффектом, который можно расценивать как дозозависимый. Максимальное подавление, Ск/Сгш« составило 1,64/0,66 = 2,48 при концентрации 10 мкмоль/л. Концентрация половинного торможения IC50 составила 7,72 мкмоль/л. Субстанция 2 незначительно снижала жизнеспособность клеток без дозозависимого эффекта. Максимальное подавление СУС,™« составляло 1,72/1,02 = 1,69 при концентрации 5 мкмоль/л, концентрация половинного торможения IC50 в исследуемом диапазоне концентраций так и не была достигнута. Эффект соединения был расценен как незначительный. Субстанция 3 практически не снижала жизнеспособность клеток в исследованном диапазоне концентраций, дозозависимого эффекта не наблюдалось. Максимальное подавление Ск/Сmax составляло 1,64/0,94 = 1,74 при концентрации 5 мкмоль/л, концентрация половинного торможения IC50 достигнута не была. Несмотря на то, что предшественник производного SE3 обладает противоопухолевой активностью, данное вещество не показало активности в отношении клеток РМЖ человека. По данным МТТ-теста субстанция 4 значительно снижала жизнеспособность клеток РМЖ во всем диапазоне концентраций. Максимальное подавление Ск/Cmax составило 2,13/0,29 = 7,34 при концентрации SE4 10 мкмоль/л, расчетное IC50 - 0,85 мкмоль/л. Стоит отметить, что производное SE4 является одним из самых токсичных из всей тестируемой выборки, его эффект можно расценивать как дозозависимый. JOURNAL ОГ VOLGOGRAD STATE MEDICAL UNIVERSITY Производное 5 умеренно снижало жизнеспособность клеток в исследованном диапазоне концентраций, зависимость от дозы не была очевидной. Максимальное подавление 0/0^ было достигнуто при концентрации 10 мкмоль/л и составило 2,13/0,75 = 2,84. Расчетная концентрация половинного торможения IC50 для SE5 оказалась равной 6,92 мкмоль/л. Субстанция была отнесена к умеренно цитотоксическим соединениям. Рис. 2. Цитотоксическая активность новых производных азолоазинов 1-6 в культуре клеток рака молочной железы человека MCF-7. Здесь и на следующем рисунке: по оси абсцисс - концентрация действующего вещества, мкмоль/л; по оси ординат - выживаемость клеток, %о Рис. 3. Цитотоксическая активность новых производных азолоазинов 7-11 и эпирубицина в культуре клеток рака молочной железы человека MGF-7 Субстанция 6, по данным МТТ-теста, демонстрировала цитотоксический эффект на всем диапазоне исследованных концентраций. Максимальное подавление СУС^ составило 2,13/0,53 = 4,02 при концентрации SE6 10 мкмоль/л. Расчетная IC50 составила 2,98 мкмоль/л. Данное производное оказалось одним соединений с высокой токсичностью в настоящей выборке. Производное 7 снижало жизнеспособность клеток РМЖ во всем диапазоне концентраций. Максимальное подавление жизнеспособности было достигнуто при концентрации 5 мкмоль/л и составило 2,61, но и при других концентрациях величины показателя существенно не различались. Расчетная IC50 составила 5,50 мкмоль/л. Соединение отнесено к веществам с умеренной цитотоксичностью. Производное 8 в умеренной степени вызвало дозозависимое снижение жизнеспособности клеток РМЖ на всем диапазоне концентраций, максимальное подавление Cк/Cmax составило 1,83/0,83 = 2,20 при максимальной концентрации 10 мкмоль/л. Расчетное половинное торможение IC50 было достигнуто при концентрации 8,44 мкмоль/л. Соединение отнесено к веществам низкой цитотоксической активностью. В следующей выборке было показано, что субстанция 9 снижала жизнеспособность клеток РМЖ во всем диапазоне концентраций. Максимальное подавление Cк/Cmax составило 1,83/0,60 = 3,05 при концентрации SE9 5 мкмоль/л. Концентрация половинного торможения IC50 оказалась равной 6,25 мкмоль/л. По итогам исследования производное 9 было отнесено к веществам с низкой цитотоксической активностью. Производное 10 по результатам МТТ-теста проявило отсутствие сколько-нибудь достоверной цито-токсической активности до концентрации 5 мкмоль/л, когда регистрировали максимальное подавление, равное 1,34. В максимальной исследуемой дозе токсический эффект достоверно не проявлялся. Концентрация половинного торможения IC50 прогнозировалась значительно выше 10 мкмоль/л. Итогом этой части исследование стало заключение об отсутствии цито-токсического эффекта производного 10. Аналогичные результаты были получены при исследовании цитотоксичности субстанции 11. По результатам МТТ-теста в изученном диапазоне концентраций также отмечалась тенденция к снижению жизнеспособности клеток РМЖ. Максимальное подавление Cк/Cmax составило 1,72/1,28 = 1,34 при концентрации 10 мкмоль/л, а расчетная концентрация половинного торможения IC50 оказалась значительно выше 10 мкмоль/л. Как итог было высказано заключение об отсутствии цитотоксической активности этого соединения. Итоговые представления о сравнительной цитотоксичности исследуемых препаратов суммированы на рис. 4. Хорошо заметно, что наибольшей активностью (и, следовательно, перспективностью для дальнейшего изучения в качестве потенциальных противоопухолевых препаратов) являются новые производные азолоазинов 4 и 6. Рис. 4. Сравнительная цитотоксическая активность новых производных азолоазинов и эпирубицина в культуре клеток рака молочной железы MCF-7. По оси абсцисс - максимальное подавление в концентрациях 0,25-10,0 мкмоль/л; по оси ординат - расчетная концентрация половинного торможения IC50, мкмоль/л Клинические испытания незаменимы как научный полигон для противоопухолевой терапии. Но сложные клинические испытания чрезвычайно дороги и трудны для выполнения по причинам материальнотехнического, нормативного, юридического и этического характера. Итак, неизбежно научному сообществу необходимы модельные системы для изучения молекулярных основ действия лекарств и других аспектов биологии рака, которые нельзя (и не следует) исследовать на людях. Линии опухолевых клеток стали толчком в развитии исследований РМЖ с начала 1970-х годов, когда были впервые созданы линия MCF-7 и серия MD Anderson [13]. С тех пор количество линий опухолевых клеток, доступных исследователям РМЖ, резко возросло. Некоторые из наиболее эффективных вариантов лечения, доступных сегодня, существуют только потому, что исследователи смогли выявить механизм заболевания, используя систему культивирования in vitro, и разработать целенаправленную терапию. Линии опухолевых клеток стали еще более мощными с появлением технологии секвенирования следующего поколения. Доступность этой технологии привела к формированию нескольких крупномасштабных инициатив по секвенированию, и они породили огромное количество практических данных. Одной из таких инициатив является Энциклопедия линий раковых клеток (CCLE). CCLE-это совместная работа между Novartis и Broad Institute, который опубликовал данные о мутациях для 1651 гена, представляющих почти 1000 клеточных линий [16]. Исследовательская группа CCLE использовала этот набор данных для сравнения - число копий, паттерн экспрессии и частота мутаций линий опухолевых клеток с первичными опухолями показали, что линии опухолевых клеток репрезентативны для их аналогов in vivo. Кроме того, были использованы данные секвенирования, которые предсказали, что линии опухолевых клеток, содержащие определенные мутации, чувствительны к определенным классам лекарств [17]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ В результате проведения исследования цитотоксичности in vitro на культуре клеток РМЖ человека MCF-7 одиннадцати новых производных азолоазинов установлено, что не все вещества имеют токсические свойства, несмотря на схожее химическое строение и механизм действия на клетку. Наименее токсичными оказались субстанции 10 и 11, у которых в максимальной исследуемой концентрации 10 мкмоль/л выживаемость клеток оказывалась 86 и 75 % соответственно. Наиболее токсичными соединениями в отношении клеток MCF-7 являются субстанции 4 и 6 с показателями цитотоксичности выше в 11,0 и 3,1 раза, по сравнению с эпи-рубицином. Полученные данные можно использовать как основу для выбора новых производных азолоазинов 4, 6 и 9 для дальнейшего изучения их генотоксических и метаболических свойств свойств на клеточных моделях и лабораторных животных как веществ с потенциальной противоопухолевой активностью.

Об авторах

Ахмед Хамид Хумаири

Волгоградский государственный медицинский университет

аспирант кафедры теоретической биохимии с курсом клинической биохимии Волгоград, Россия

Олег Владимирович Островский

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: l.ostr@gmail.com
доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой теоретической биохимии с курсом клинической биохимии Волгоград, Россия

Екатерина Владимировна Зыкова

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: qeenkat@mail.ru
кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры теоретической биохимии с курсом клинической биохимии Волгоград, Россия

Дмитрий Леонидович Сперанский

Волгоградский государственный медицинский университет

Email: d_speransky@mail.ru
доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры онкологии, гематологии и трансплантологии Института непрерывного медицинского и фармацевтического образования Волгоград, Россия

Дарья Леонидовна Алексеева

Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина

Email: aprildar@yandex.ru
аспирант кафедры технологии органического синтеза, химико-технологический институт Екатеринбург, Россия

Елена Владимировна Садчикова

Уральский федеральный университет имени первого Президента России Б.Н. Ельцина

Email: selena-ekb@rambler.ru
кандидат химических наук, доцент кафедры технологии органического синтеза химико-технологического института Екатеринбург, Россия

Список литературы

Дополнительные файлы