Protective effect of a combination of the peptide mimicking the spatial structure of the B erythropoietin chain and infliximab on the epithelium of the nephron tubules in renal ischemia-reperfusion injury

Alexander S. Netrebenko; Нетребенко Александр Сергеевич; Vladimir V. Gureev; Гуреев Владимир Владимирович; Mikhail V. Pokrovsky; Покровский Михаил Владимирович; Vladimir I. Yakushev; Якушев Владимир Иванович; Elena G. Saprykina; Сапрыкина Елена Геннадьевна; Maria A. Zatolokina; Затолокина Мария Алексеевна

doi:10.19163/1994-9480-2023-20-2-168-171

Протективное влияние комбинации пептида, имитирующего альфа-спираль эритропоэтина бета, и инфликсимаба на эпителий канальцев нефрона при ишемически-реперфузионном повреждении почек

Авторы: Нетребенко А.С.¹, Гуреев В.В.¹, Покровский М.В.¹, Якушев В.И.¹, Сапрыкина Е.Г.¹, Затолокина М.А.²^,3
Учреждения:
1. Белгородский государственный национальный исследовательский университет
2. Курский государственный медицинский университет
3. Орловский государственный университет имени И.С. Тургенева
Выпуск: Том 20, № 2 (2023)
Страницы: 168-171
Раздел: Оригинальные исследования
URL: https://journals.eco-vector.com/1994-9480/article/view/567872
DOI: https://doi.org/10.19163/1994-9480-2023-20-2-168-171
ID: 567872

Цитировать

Полный текст

Аннотация
Полный текст
Об авторах
Список литературы
Дополнительные файлы
Статистика

Аннотация

Введение. В связи с тяжелым клиническим течением и высокой социально-экономической значимостью острого повреждения почек на повестке ученого сообщества всего мира остро стоит вопрос о методах диагностики и лечения данной патологии. Одним из наиболее специфичных биомаркеров острого повреждения почек является KIM-1. KIM-1 представляет собой апикальный трансмембранный белок проксимального отдела почечных канальцев. Повышенные уровни KIM-1 при моделировании ишемически-реперфузионной травмы почек коррелируют с воспалением и фиброзом в гистологических исследованиях. Целью данной работы явилось исследование протективных эффектов комбинации пептида, имитирующего альфа-спираль эритропоэтина бета (pHBSP), и инфликсимаба на эпителий канальцев нефрона при ишемически-реперфузионном повреждении почек. Материалы и методы. Эксперимент проводился на 80 белых лабораторных крысах-самцах линии Wistar массой 280–320 г. Животным вводили пептид, имитирующий альфа-спираль эритропоэтина бета (pHBSP), и инфликсимаб. Под наркозом выполнялось наложение атравматичных сосудистых зажимов на левую почечную ножку на 40 мин, нефрэктомия справа. В течение 12 ч после реперфузии производился сбор образцов мочи для лабораторных исследований. Результаты. По результатам эксперимента установлено, что использование комбинации пептида, имитирующего альфа-спираль эритропоэтина бета (pHBSP), и инфликсимаба более эффективно защищало эпителий канальцев нефрона от повреждений при ишемически-реперфузионной травме почек, чем введение пептида, имитирующего альфа-спираль эритропоэтина бета, или инфликсимаба в монорежиме. Выводы. Результаты проведенного исследования наглядно обосновывают перспективность совместного применения пептида, имитирующего альфа-спираль эритропоэтина бета (pHBSP), и инфликсимаба с целью протекции эпителия канальцев нефрона от ишемически-реперфузионного повреждения.

Ключевые слова

pHBSP, инфликсимаб, ишемически-реперфузионное повреждение почек, KIM-1

Полный текст

В связи с тяжелым клиническим течением и высокой социально-экономической значимостью острого повреждения почек (ОПП) на повестке ученого сообщества всего мира остро стоит вопрос о методах диагностики и лечения данной патологии. Одним из наиболее специфичных биомаркеров острого повреждения почек является KIM-1. KIM-1 представляет собой апикальный трансмембранный белок проксимального отдела почечных канальцев. Повышенные уровни KIM-1 при моделировании ишемически-реперфузионной травмы почек коррелируют с воспалением и фиброзом в гистологических исследованиях [1].

При ишемическом/токсическом повреждении почки внеклеточный домен KIM-1 отделяется от мембраны под действием матриксной металлопротеиназы (ММР), что приводит к значительному повышению уровня KIM-1 в моче [2]. Так, у пациентов с ОПП концентрация KIM-1 в моче может превышать норму в 50 и более раз [3]. KIM-1 подавляет секрецию цитокинов клетками проксимальных канальцев, модулирует трансляционные изменения посредством пути ядерного фактора kappa-light-chain-enhancer активированных бета-клеток (NF-kB) [4]. Экспериментально доказано, что нарастающая экспрессия гена KIM-1 отражает продолжающееся повреждение различных тубулоинтерстициальных сегментов нефрона и коркового вещества почек [5]. По этим причинам авторы начали рассматривать KIM-1 как биомаркер, способный выявлять раннее ОПП и даже играть возможную прогностическую роль [6].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Диагностика протективных эффектов комбинации пептида, имитирующего альфа-спираль эритропоэтина бета (pHBSP), и инфликсимаба на эпителий канальцев нефрона с помощью определения биомаркера KIM-1 в моче при ишемически-реперфузионном повреждении почек.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проведено на базе Центра доклинических и клинических исследований ФГАОУ ВО НИУ БеЛГУ. Этические нормы обращения с лабораторными животными соответствовали Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22Sep2010 on the protection of animals used for scientific purposes.

Эксперимент проводился на 80 белых лабо-раторных крысах-самцах линии Wistar массой 280–320 г. Животные были разделены на 8 групп, по 10 особей в каждой:

Ложнооперированные животные.
Ишемия/реперфузия (I/R (контроль).
Ишемия-реперфузия + рекомбинантный эритропоэтин 50 МЕ/кг внутрибрюшинно за 30 мин до моделирования ишемии.
Ишемия/реперфузия + пептид, имитирующий альфа-спираль эритропоэтина бета (pHBSP), 5 мкг/кг внутрибрюшинно за 30 мин до моделирования ишемии.
Ишемия/реперфузия + пептид, имитирующий альфа-спираль эритропоэтина бета (pHBSP), 25 мкг/кг внутрибрюшинно за 30 мин до моделирования ишемии.
Ишемия/реперфузия + Инфликсимаб [Remi-cade®, MSD Ireland (Brinney)] 2 мг/кг внутрибрюшинно за 1 ч до моделирования ишемии.
Ишемия/реперфузия + Инфликсимаб [Remi-cade®, MSD Ireland (Brinney)] 10 мг/кг внутрибрюшинно за 1 ч до моделирования ишемии.
Ишемия/реперфузия + пептид, имитирующий альфа-спираль эритропоэтина бета (pHBSP), 25 мкг/кг внутрибрюшинно за 30 мин до моделирования ишемии + Инфликсимаб [Remicade®, MSD Ireland (Brinney)] 10 мг/кг внутрибрюшинно за 1 ч до моделирования ишемии.

Под наркозом (хлоралгидрат, 300 мг/кг внутрибрюшинно) после предварительной обработки передней брюшной стенки выполнялась срединная лапаротомия. Петли кишечника мобилизовывались, вскрывалось забрюшинное пространство, производилось выделение почки с элементами почечной ножки. Выполнялось наложение атравматичных сосудистых зажимов на левую почечную ножку на 40 мин с последующей реперфузией. Эффективность наступления ишемии оценивалась по изменению цвета почки. Нефрэктомия справа [7]. Далее в брюшную полость вводили 4–5 мл теплого 0,9%-го раствора натрия хлорида, затем рану послойно ушивали.

В послеоперационном периоде животные находились в специальных метаболических клетках для сбора мочи в течение 12 часов с обеспечением свободного доступа к воде.

После окончания сбора образцы мочи предварительно центрифугировали при 1 500 об./мин в течение 15 мин и хранили при температуре –70 ºС до момента исследования. Определение концентрации KIM-1 в моче производили с помощью набора для ИФА Rat KIM-1 ELISA Kit (Elabscience Biotechnology Inc., США) с использованием автоматического прибора Watcher Bio-RAD PW40 и иммуноферментного анализатора Microplate reader Bio-RAD 680 (Bio-RAD Laboratories Inc., США).

Статистическую обработку проводили с использованием программной среды вычислений R. Характер распределения признаков в статистической выборке определяли с помощью критерия Шапиро – Уилка и критерия Шпигельхальтера (библиотека normtest), оценку равенства дисперсий – с помощью критерия Левене (библиотека lawstat). В зависимости от типа распределения признаков и равенства дисперсий значимость полученных результатов оценивали с применением параметрического (ANOVA) или непараметрического (критерий Краскела – Уоллиса) однофакторного дисперсионного анализа, а в качестве post-hoc анализа для выявления различий при межгрупповых сравнениях использовали непарный t-критерий Стьюдента или критерий Манна – Уитни, соответственно, с поправкой Бенджамини – Хохберга на множественную проверку гипотез. Результаты считали достоверными при p ≤ 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При анализе уровня KIM-1 в моче ложнооперированных животных зарегистрирован результат (0,35 ± 0,03) нг/мл, что сопоставимо с данным, опубликованными в международной и отечественной литературе [8]. При моделировании ишемически-реперфузионной травмы почки спустя 12 ч реперфузии показатель KIM-1 в моче животных данной группы составил (12,5 ± 0,8) нг/мл, что достоверно свидетельствует о выраженных патологических изменениях в эпителии проксимальных отделов трубочек нефрона.

Введение рекомбинантного человеческого эритропоэтина оказывало достоверный нефропротективный эффект, что подтверждается снижением уровня KIM-1 мочи до (6,55 ± 0,68) нг/мл, что, однако, более чем в 18 раз превосходит данный показатель у ложнооперированных животных.

Значительное дозозависимое ренопротективное действие отмечено на фоне профилактики ишемически-реперфузионных повреждений пептидом, имитирующим альфа-спираль эритропоэтина бета (pHBSP, ARA290) в дозе 5 и 25 мкг/кг: показатель уровня KIM-1 в группе животных pHBSP 25 мкг/кг был в 1,6 раза ниже, чем в группе животных, получавших рекомбинантный эритропоэтин.

На фоне применения инфликсимаба в обеих дозировках отмечено достоверное, но менее выраженное снижение показателя повреждения апикальной мембраны проксимального тубулярного эпителия: уровень KIM-1 в группах животных, получавших инфликсимаб в дозировке 2 и 10 мг/кг, составил соответственно (9,5 ± 0,53) и (7,95 ± 0,68) нг/мл.

Наиболее выраженный протективный эффект на эпителий проксимальных канальцев нефрона отмечен при профилактическом введении комбинации пептида, имитирующего альфа-спираль эритропоэтина бета, и инфликсимаба: показатель KIM-1 в моче у данной группы животных был наиболее приближен к уровню KIM-1 в моче ложнооперированных животных, в 7 раз ниже, чем в группе ишемии-реперфузии, и более чем в 2 раза ниже, чем данный показатель при применении pHBSP в дозе 25 мкг/кг или инфликсимаба в дозе 10 мг/кг в монорежиме (рис.).

Рис. Уровень KIM-1 в моче исследуемых групп животных через 12 часов реперфузии

Белок KIM-1 обладает свойствами идеального маркера почечного повреждения: его концентрация в моче минимальна при нормальной работе почек и резко повышается при повреждении апикальной мембраны проксимального тубулярного эпителия, персистируя до полного восстановления функции канальцев. Благодаря этим качествам в данной работе использовали диагностику уровня KIM-1 мочи в качестве оценки степени тяжести развития острого повреждения почек в эксперименте, а также изменения его уровня в зависимости от введения исследуемых препаратов, что может показать степень их нефропротективной активности на ранних, доклинических этапах (спустя 12 ч реперфузии), и косвенно охарактеризовать прогноз исхода моделируемого ОПП.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итоги проведенного эксперимента подтверждают наличие ренопротективных эффектов от применения пептида, имитирующего имитирующего альфа-спираль эритропоэтина бета, и инфликсимаба с целью снижения декструктивных процессов в эпителии канальцев нефрона при моделировании ишемически-реперфузионной травмы почек, что подтверждается снижением уровня KIM-1 в моче исследуемых животных в сравнении с группой моделирования патологии. Наиболее выраженное защитное действие продемонстрировало применение комбинации изучаемых веществ: на фоне сочетанного введения пептида, имитирующего имитирующего альфа-спираль эритропоэтина бета, и инфликсимаба показатель KIM-1 составил (1,78 ± 0,37) нг/мл, что достоверно ниже, чем при профилактике ишемически-реперфузионной травмы пептидом, имитирующим имитирующего альфа-спираль эритропоэтина бета, или инфликсимабом при их селективном использовании. Данный результат подтверждает значительное протективное действие данной комбинации на эпителий канальцев нефрона, что способствует снижению биохимических маркеров нарушения функции почек и восстановлению фракционной экскреции натрия.