Protective effect of a combination of the peptide mimicking the spatial structure of the B erythropoietin chain and infliximab on the epithelium of the nephron tubules in renal ischemia-reperfusion injury

Alexander S. Netrebenko; Нетребенко Александр Сергеевич; Vladimir V. Gureev; Гуреев Владимир Владимирович; Mikhail V. Pokrovsky; Покровский Михаил Владимирович; Vladimir I. Yakushev; Якушев Владимир Иванович; Elena G. Saprykina; Сапрыкина Елена Геннадьевна; Maria A. Zatolokina; Затолокина Мария Алексеевна

doi:10.19163/1994-9480-2023-20-2-168-171

Protective effect of a combination of the peptide mimicking the spatial structure of the B erythropoietin chain and infliximab on the epithelium of the nephron tubules in renal ischemia-reperfusion injury

Authors: Netrebenko A.S.¹, Gureev V.V.¹, Pokrovsky M.V.¹, Yakushev V.I.¹, Saprykina E.G.¹, Zatolokina M.A.²^,3
Affiliations:
1. Belgorod State National Research University
2. Kursk State Medical University
3. I.S. Turgenev Orel State University
Issue: Vol 20, No 2 (2023)
Pages: 168-171
Section: Original Researches
URL: https://journals.eco-vector.com/1994-9480/article/view/567872
DOI: https://doi.org/10.19163/1994-9480-2023-20-2-168-171
ID: 567872

Cite item

Full Text

Abstract
Full Text
About the authors
References
Supplementary files
Statistics

Abstract

Purpose: Due to the severe clinical course and the high socio-economic significance of acute kidney injury, the issue of methods for diagnosing and treating this pathology is on the agenda of the scientific community around the world. One of the most specific biomarkers of acute kidney injury is KIM-1. KIM-1 is an apical transmembrane protein of the proximal renal tubule. Elevated levels of KIM-1 in a model of ischemia-reperfusion injury of the kidneys correlate with inflammation and fibrosis in histological studies. The aim of this work was to study the protective effects of a combination of a peptide mimicking the α-helix B of erythropoietin (pHBSP) and infliximab on the epithelium of nephron tubules in ischemia-reperfusion injury of the kidneys. Methods: The experiment was conducted on 80 white laboratory male Wistar rats weighing 280–320 g. Animals were injected with a peptide mimicking the α-helix B of erythropoietin (pHBSP) and infliximab. Under anesthesia, atraumatic vascular clamps were applied to the left renal pedicle for 40 minutes, nephrectomy on the right. Within 12 hours after reperfusion, urine samples were collected for laboratory studies. Results: According to the results of the experiment, it was found that the use of a combination of a peptide mimicking the α-helix B of erythropoietin (pHBSP) and infliximab more effectively protected the epithelium of the nephron tubules from damage during ischemia-reperfusion injury of the kidneys than the administration of a peptide mimicking the α-helix B of erythropoietin or infliximab in mono mode. Conclusion: The results of the study clearly substantiate the prospects for the combined use of a peptide mimicking the α-helix B of erythropoietin (pHBSP) and infliximab to protect the nephron tubule epithelium from ischemia-reperfusion injury.

Keywords

pHBSP, infliximab, renal ischemia-reperfusion injury, KIM-1

Full Text

В связи с тяжелым клиническим течением и высокой социально-экономической значимостью острого повреждения почек (ОПП) на повестке ученого сообщества всего мира остро стоит вопрос о методах диагностики и лечения данной патологии. Одним из наиболее специфичных биомаркеров острого повреждения почек является KIM-1. KIM-1 представляет собой апикальный трансмембранный белок проксимального отдела почечных канальцев. Повышенные уровни KIM-1 при моделировании ишемически-реперфузионной травмы почек коррелируют с воспалением и фиброзом в гистологических исследованиях [1].

При ишемическом/токсическом повреждении почки внеклеточный домен KIM-1 отделяется от мембраны под действием матриксной металлопротеиназы (ММР), что приводит к значительному повышению уровня KIM-1 в моче [2]. Так, у пациентов с ОПП концентрация KIM-1 в моче может превышать норму в 50 и более раз [3]. KIM-1 подавляет секрецию цитокинов клетками проксимальных канальцев, модулирует трансляционные изменения посредством пути ядерного фактора kappa-light-chain-enhancer активированных бета-клеток (NF-kB) [4]. Экспериментально доказано, что нарастающая экспрессия гена KIM-1 отражает продолжающееся повреждение различных тубулоинтерстициальных сегментов нефрона и коркового вещества почек [5]. По этим причинам авторы начали рассматривать KIM-1 как биомаркер, способный выявлять раннее ОПП и даже играть возможную прогностическую роль [6].

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Диагностика протективных эффектов комбинации пептида, имитирующего альфа-спираль эритропоэтина бета (pHBSP), и инфликсимаба на эпителий канальцев нефрона с помощью определения биомаркера KIM-1 в моче при ишемически-реперфузионном повреждении почек.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проведено на базе Центра доклинических и клинических исследований ФГАОУ ВО НИУ БеЛГУ. Этические нормы обращения с лабораторными животными соответствовали Directive 2010/63/EU of the European Parliament and of the Council of 22Sep2010 on the protection of animals used for scientific purposes.

Эксперимент проводился на 80 белых лабо-раторных крысах-самцах линии Wistar массой 280–320 г. Животные были разделены на 8 групп, по 10 особей в каждой:

Ложнооперированные животные.
Ишемия/реперфузия (I/R (контроль).
Ишемия-реперфузия + рекомбинантный эритропоэтин 50 МЕ/кг внутрибрюшинно за 30 мин до моделирования ишемии.
Ишемия/реперфузия + пептид, имитирующий альфа-спираль эритропоэтина бета (pHBSP), 5 мкг/кг внутрибрюшинно за 30 мин до моделирования ишемии.
Ишемия/реперфузия + пептид, имитирующий альфа-спираль эритропоэтина бета (pHBSP), 25 мкг/кг внутрибрюшинно за 30 мин до моделирования ишемии.
Ишемия/реперфузия + Инфликсимаб [Remi-cade®, MSD Ireland (Brinney)] 2 мг/кг внутрибрюшинно за 1 ч до моделирования ишемии.
Ишемия/реперфузия + Инфликсимаб [Remi-cade®, MSD Ireland (Brinney)] 10 мг/кг внутрибрюшинно за 1 ч до моделирования ишемии.
Ишемия/реперфузия + пептид, имитирующий альфа-спираль эритропоэтина бета (pHBSP), 25 мкг/кг внутрибрюшинно за 30 мин до моделирования ишемии + Инфликсимаб [Remicade®, MSD Ireland (Brinney)] 10 мг/кг внутрибрюшинно за 1 ч до моделирования ишемии.

Под наркозом (хлоралгидрат, 300 мг/кг внутрибрюшинно) после предварительной обработки передней брюшной стенки выполнялась срединная лапаротомия. Петли кишечника мобилизовывались, вскрывалось забрюшинное пространство, производилось выделение почки с элементами почечной ножки. Выполнялось наложение атравматичных сосудистых зажимов на левую почечную ножку на 40 мин с последующей реперфузией. Эффективность наступления ишемии оценивалась по изменению цвета почки. Нефрэктомия справа [7]. Далее в брюшную полость вводили 4–5 мл теплого 0,9%-го раствора натрия хлорида, затем рану послойно ушивали.

В послеоперационном периоде животные находились в специальных метаболических клетках для сбора мочи в течение 12 часов с обеспечением свободного доступа к воде.

После окончания сбора образцы мочи предварительно центрифугировали при 1 500 об./мин в течение 15 мин и хранили при температуре –70 ºС до момента исследования. Определение концентрации KIM-1 в моче производили с помощью набора для ИФА Rat KIM-1 ELISA Kit (Elabscience Biotechnology Inc., США) с использованием автоматического прибора Watcher Bio-RAD PW40 и иммуноферментного анализатора Microplate reader Bio-RAD 680 (Bio-RAD Laboratories Inc., США).

Статистическую обработку проводили с использованием программной среды вычислений R. Характер распределения признаков в статистической выборке определяли с помощью критерия Шапиро – Уилка и критерия Шпигельхальтера (библиотека normtest), оценку равенства дисперсий – с помощью критерия Левене (библиотека lawstat). В зависимости от типа распределения признаков и равенства дисперсий значимость полученных результатов оценивали с применением параметрического (ANOVA) или непараметрического (критерий Краскела – Уоллиса) однофакторного дисперсионного анализа, а в качестве post-hoc анализа для выявления различий при межгрупповых сравнениях использовали непарный t-критерий Стьюдента или критерий Манна – Уитни, соответственно, с поправкой Бенджамини – Хохберга на множественную проверку гипотез. Результаты считали достоверными при p ≤ 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При анализе уровня KIM-1 в моче ложнооперированных животных зарегистрирован результат (0,35 ± 0,03) нг/мл, что сопоставимо с данным, опубликованными в международной и отечественной литературе [8]. При моделировании ишемически-реперфузионной травмы почки спустя 12 ч реперфузии показатель KIM-1 в моче животных данной группы составил (12,5 ± 0,8) нг/мл, что достоверно свидетельствует о выраженных патологических изменениях в эпителии проксимальных отделов трубочек нефрона.

Введение рекомбинантного человеческого эритропоэтина оказывало достоверный нефропротективный эффект, что подтверждается снижением уровня KIM-1 мочи до (6,55 ± 0,68) нг/мл, что, однако, более чем в 18 раз превосходит данный показатель у ложнооперированных животных.

Значительное дозозависимое ренопротективное действие отмечено на фоне профилактики ишемически-реперфузионных повреждений пептидом, имитирующим альфа-спираль эритропоэтина бета (pHBSP, ARA290) в дозе 5 и 25 мкг/кг: показатель уровня KIM-1 в группе животных pHBSP 25 мкг/кг был в 1,6 раза ниже, чем в группе животных, получавших рекомбинантный эритропоэтин.

На фоне применения инфликсимаба в обеих дозировках отмечено достоверное, но менее выраженное снижение показателя повреждения апикальной мембраны проксимального тубулярного эпителия: уровень KIM-1 в группах животных, получавших инфликсимаб в дозировке 2 и 10 мг/кг, составил соответственно (9,5 ± 0,53) и (7,95 ± 0,68) нг/мл.

Наиболее выраженный протективный эффект на эпителий проксимальных канальцев нефрона отмечен при профилактическом введении комбинации пептида, имитирующего альфа-спираль эритропоэтина бета, и инфликсимаба: показатель KIM-1 в моче у данной группы животных был наиболее приближен к уровню KIM-1 в моче ложнооперированных животных, в 7 раз ниже, чем в группе ишемии-реперфузии, и более чем в 2 раза ниже, чем данный показатель при применении pHBSP в дозе 25 мкг/кг или инфликсимаба в дозе 10 мг/кг в монорежиме (рис.).

Рис. Уровень KIM-1 в моче исследуемых групп животных через 12 часов реперфузии

Белок KIM-1 обладает свойствами идеального маркера почечного повреждения: его концентрация в моче минимальна при нормальной работе почек и резко повышается при повреждении апикальной мембраны проксимального тубулярного эпителия, персистируя до полного восстановления функции канальцев. Благодаря этим качествам в данной работе использовали диагностику уровня KIM-1 мочи в качестве оценки степени тяжести развития острого повреждения почек в эксперименте, а также изменения его уровня в зависимости от введения исследуемых препаратов, что может показать степень их нефропротективной активности на ранних, доклинических этапах (спустя 12 ч реперфузии), и косвенно охарактеризовать прогноз исхода моделируемого ОПП.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итоги проведенного эксперимента подтверждают наличие ренопротективных эффектов от применения пептида, имитирующего имитирующего альфа-спираль эритропоэтина бета, и инфликсимаба с целью снижения декструктивных процессов в эпителии канальцев нефрона при моделировании ишемически-реперфузионной травмы почек, что подтверждается снижением уровня KIM-1 в моче исследуемых животных в сравнении с группой моделирования патологии. Наиболее выраженное защитное действие продемонстрировало применение комбинации изучаемых веществ: на фоне сочетанного введения пептида, имитирующего имитирующего альфа-спираль эритропоэтина бета, и инфликсимаба показатель KIM-1 составил (1,78 ± 0,37) нг/мл, что достоверно ниже, чем при профилактике ишемически-реперфузионной травмы пептидом, имитирующим имитирующего альфа-спираль эритропоэтина бета, или инфликсимабом при их селективном использовании. Данный результат подтверждает значительное протективное действие данной комбинации на эпителий канальцев нефрона, что способствует снижению биохимических маркеров нарушения функции почек и восстановлению фракционной экскреции натрия.