THE CHARACTERISTIC OF MORPHOLOGICAL CHANGES OF HIPPOCAMPAUS OLD RATS AS A RESULT OF STRESS

全文:

Процесс адаптации к различным повреждающим ной (повреждающей) стрессорной реакцией, так и ос-факторам, которые в общей форме можно обозначить лаблением стресслимитирующих систем [1]. как стрессоры, в организме осуществляется на всех Большое количество исследований, проведенных уровнях интеграции — от молекулярного и клеточного на животных моделях стресса, свидетельствует о раз-до системного [3, 8]. Литературные данные свидетель- витии морфофункциональных изменениях в структурах ствуют о том, что при старении развивается резистент- лимбической системы, обеспечивающей уровень эмо-ность кортикотропина к ингибирующему влиянию глю- ционального восприятия воздействующего фактора. кокортикоидов [8], что приводит к нарушению гомеос- Так, под влиянием длительного стресса у грызунов и татического контроля функции кортикотропоцитов низших приматов происходит уменьшение объема гип-гипофиза, к чрезмерной стимуляции надпочечников, покампа. Гиппокампальные апикальные дендриты уко-увеличению уровня глюкокортикоидов в крови и к из- рачиваются под воздействием однократной экспозиции менениям в нейронах ствола головного мозга, гип- глюкокортикоидов или под влиянием стресса [7]. покампа, гипоталамуса в различные возрастные пери- Под влиянием экстремальных условий (хронический оды. Повышающаяся по мере старения уязвимость стресс или длительное введение глюкокортикоидов) воз-организма к действию неблагоприятных факторов окру- можно уменьшение общего числа нейронов в гиппо-жающей среды может быть обусловлена как избыточ- кампе. Также показана корреляция между высоким 14 = Выпуск 2 (46). 2013 ©зшірСз [ЩсоШтІГІМЩ уровнем кортизола и уменьшением объема гиппокампа у здоровых индивидуумов в процессе старения [1]. Активация индуцибельной NO-синтазы (iNOS) считается основным источником повышенной продукции NO в мозге в условиях различных патологий, включая различные нейродегенеративные процессы. В ряде экспериментальных работ было показано, что стресс вызывает усиление экспрессии nNOS и iNOS во многих отделах головного мозга, с преобладанием в новой коре и гиппокампе, а NO принимает участие в реализации эффектов стресса [5]. Однако характер структурных изменений в гиппокампе в стареющем организме при стрессовом воздействии с позиций активации компонентов системы оксида азота остается малоизученным. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Определение структурных особенностей гиппокампа старых (24-месячных) крыс на фоне стрессового воздействия. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Экспериментальные исследования проводили в условиях НИИ Фармакологии. В экспериментальной группе 10 белых крыс самцов в возрасте 24 месяца подвергались комбинированному стрессовому воздействию (вибраций, шумов, света) в течение 7 дней, после чего выводились из эксперимента. Животные забивались под эфирным наркозом в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных». Адекватность модели оценивали по развитию кровоизлияний, эрозий и язв в желудочно-кишечном тракте. Контролем служили 10 самцов того же возраста. Головной мозг фиксировали в 10%-м нейтральном формалине, с дальнейшим обезвоживанием в батарее спиртов и изготовлением парафиновых блоков. Получали срезы толщиной 5—7 мкм. Производили окрашивание срезов гематоксилином и эозином, тионином по методу Ниссля. Иммуногистохимическое исследование проводили с использованием поликлональных первичных антител к iNOS. Фотодокументирование осуществляли цифровой фотокамерой Olympus (Япония). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ При микроскопическом изучении вентральных отделов гиппокампа у 24-месячных контрольных крыс выявлены следующие особенности гистологического строения. Нейроны пирамидного слоя зоны СА1 зоны характеризовались округлой формой ядра и близкой к округлой формой перикариона, равномерным распределением субстанции Нисля в цитоплазме. Однако встречались и единичные гиперхром-ные клетки. В СА3 зоне нейроны пирамидного слоя располагались более дисперсно, имели полигональную (треугольную) форму с четко визуализируемым ядром и одним ядрышком. У стрессированных животных того же возраста отмечались более выраженные морфологические изме нения в зоне СА3 гиппокампа. Наблюдалось уменьшение, по сравнению с контролем, ширины пирамидного слоя и плотности расположения нейронов. Кроме того, были обнаружены участки очаговых выпадений нейро-цитов. При окраске по методу Ниссля часть нейронов пирамидного слоя характеризовалась разнообразными неспецифическими изменениями в виде гиперхрома-тоза, хроматолиза и сморщивания (рис. 1). Кроме того, определялись поврежденные нейроны в пирамидном слое, которые характеризовались наличием интенсивной базофилии цитоплазмы перикариона, в ряде случаев пикнозом ядер и уменьшением размеров перикари-она. В остальных отделах аммонова рога и зубчатой извилины существенных патоморфологических изменений, по сравнению с животными контрольной группы, выявлено не было. Рис. 1. Дистрофические изменения в нейронах пирамидного слоя гиппокампа (СА1 зона). Головной мозг 24-месячной крысы на фоне семидневного комбинированного стресса. Окраска тионином по методу Ниссля. Увеличение X 400 В дорсальных отделах гиппокампа наблюдались схожие морфологические изменения. В обеих исследуемых группах животных темные, гиперхромные нейроны выявлялись в пирамидном слое аммонова рога (зона СА3) и гранулярном слое зубчатой извилины. В краевом (полиморфном) слое, содержащем тела кор-зинчатых нейронов гиппокампа также обнаруживались единичные гиперхромные клетки. В группе срессирован-ных животных значимые морфологические изменения наблюдались только у отдельных животных в виде участков пирамидного слоя зоны СА3 с наличием большого количества сморщенных, извитых нейронов с гиперх-ромной цитоплазмой. Необходимо отметить, что данные изменения были более выражены в левом полушарии. При иммуногистохимическом исследовании с использованием антител к iNOS в обеих исследуемых группах выявлена цитоплазматическая экспрессия им-мунореактивного материала (индуцибельная NO-синта-за) мозаично в перикарионах нейронов, их отростках и некоторых глиальных клетках молекулярного, лакунар- Выпуск 2 (46). 2013 15 ного, пирамидного и радиального слоев гиппокампа. Экспрессия имммунопозитивного материала обнаруживалась во всех зонах и слоях гиппокампа. Необходимо отметить, что в пирамидных клетках СА1 и СА3 зон гиппокампа распределение иммунопозитивного материала носило неравномерный характер. В изучаемых экспериментальных группах животных умеренная экспрессия iNOS выявлялась в цитоплазме большинства нервных клеток, в то же время встречались единичные нейроны с более интенсивно окрашенным ядром и цитоплазмой. При этом у животных, подвергшихся стрессовому воздействию, интенсивность экспрессии имму-нореактивного материала в перикарионах нейронов, в целом, существенно не отличалась от крыс контрольной группы. Однако обращает на себя внимание более выраженное иммунопозитивное окрашивание нейропи-ля и отростков нейронов в stratum radiatum и stratum lucidum СА3 зоны гиппокампа стрессированных животных по сравнению с контрольной группой (рис. 2). При этом отмечалось увеличение ширины области им-мунореактивных волокон радиального слоя. Рис. 2. Экспрессия иммунопозитвного материала в мшистых волокнах stratum lucidum СА3 зоны гиппокампа. А. Головной мозг 24-месячной крысы на фоне семидневного комбинированного стресса. Б. Головной мозг 24-месячной крысы (контроль). Иммуногистохимическая реакция на индуцибельную Юст-пазу Докраска гематоксилином Увеличение х 400 В зубчатой извилине обнаруживалась цитоплазматическая экспрессия иммунореактивного материала (индуцибельная NO-синтаза) мозаично в перикарионах нейронов гранулярного слоя. В субгранулярных отделах зубчатой извилины наблюдается иммунопозитив-ное окрашивание отростков нейронов, несколько более выраженное у стрессированных животных по сравнению с контрольной группой. Полученные нами данные свидетельствуют о развитии патоморфологических изменений и нарушений цитоархитектоники гиппокампа у 24-месячных крыс-сам-цов в результате стрессового воздействия. При этом более выраженный характер изменения носили в зоне СА3 аммонова рога. В другом исследовании авторами было показано, что у грызунов стресс приводит к ремоделированию апикальных дендритов пирамидальных нейронов гиппокампального субрегиона СА3, которое выражается в снижении числа и длины апикальных дендритов [9]. Наблюдающаяся в нашем эксперименте асимметрия микроскопических изменений согласуется с литературными данными, свидетельствующими о существовании межполушарной асимметрии гистологического строения гиппокампа, как при нормальном старении, так и при развитии различных патологических процессов [7]. Реализация влияния гуморального звена стрессовой реакции на головной мозг определяется как вне-, так и внутриклеточными сигнальными путями, среди которых большое значение имеет оксид азота (NO). Негативное влияние гиперпродукции iNOS связывают с повышенным образованием свободнорадикальных продуктов: в комбинации с супероксидными радикалами NO образованием токсического пероксинитрита, способствующего повреждению клеточных мембран, липидов, белка, ДНК и в целом клеток и ведущего к ней-родегенеративным повреждениям [1]. Полученные нами данные свидетельствуют об экспресии индуцибельной изоформы NOS как в процессе «нормального» старения (интактные животные), так и на фоне стрессового воздействия. При этом различия в интенсивности им-муногистохимического окрашивания цитоплазмы нейронов носили не достоверный характер в исследуемых экспериментальных группах, что, на данном этапе исследования, не позволяет связать выявленные дистрофические изменения нейронов в гиппокампе стрессированных животных с активацией индуцибельной NO-синтазы. Однако мы выявили более интенсивное окрашивание нервных волокон stratum lucidum и отростков нейронов радиального слоя СА3 зоны гиппокампа животных, подвергшихся стрессу. Данные волокна представлены базальными немиелинизированными аксонами гранулярных клеток зубчатой извилины, которые образуя параллельные пучки, покидают гранулярный слой, входят в хилус и далее в CA3, где образуют многочисленные синаптические контакты с дендритными отростками пирамидных клеток. По литературным данным, повреждение волокон и рецепторов данной 16 Выпуск 2 (46). 2013 ©зшірСз [ЩсоШтІГІМЩ области может приводить к развитию гиппокампальной дисфункции, проявляющейся нарушением поведения и пространственного обучения [6]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, на экспериментальном материале у старых крыс (24-месячного возраста) при комбинированном стрессовом воздействии выявлены патоморфологические изменения в различных зонах гиппокампа, носящие асимметричный характер в правом и левом полушарии. Наиболее значимые патогистологические изменения выявлены в нейронах пирамидного слоя СА3 зоны вентрального гиппокампа, которые характеризовались развитием дистрофических изменений при увеличении количества гиперхромных (поврежденных) клеток, обнаружены участки очаговых выпадений нейроцитов. При этом иммуногисто-химическое исследование с использованием первичных поликлональных антител к индуцибельной нит-роосидсинтазе (iNOS) в структурах гиппокампа выявило более интенсивное окрашивание нейропиля и нервных волокон в stratum radiatum и stratum lucidum СА3 зоны гиппокампа животных, подвергшихся стрессу, а также расширение иммунореактивной области в радиальном слое и субгранулярной зоне зубчатой извилины гиппокампа при стрессе, что может свидетельствовать о развитии гиппокампальной дисфункции и нарушении процесса нормального ней рогенеза у стареющих животных в условиях стрессового воздействия.

作者简介

A. Smirnov

I. Tyurenkov

M. Schmidt

Email: schmidtmed@mail.ru

G. Snigur

V. Perfilova

N. Aksenova

D. Borodin

V. Danilenko

P. Hloponin

N. Bogomolova

E. Gubanova

参考

补充文件