METALLOPROTEINASES 1 AND 13 AS MARKERS OF DESTRUCTIVE AND PROLIFERATIVE PROCESSES IN THE ARTICULAR CARTILAGE IN EXPERIMENTAL OSTEOARTHRITIS

Full Text

Матриксные металлопротеиназы (ММР), относящиеся к семейству цинковых металлопротеиназ, участвуют в обмене белков межклеточного матрикса. Ведущая роль в процессе физиологического ремоделирования гиалинового хряща сустава отведена металлопротеиназам, относящимся к классу коллаге-наз (ММР-1, ММР-13 и др.) [1]. В норме металлопротеиназы (декретируются фиброб-ластами, хондроцитами, эпителиальными клетками, макрофагами в очень малых количествах в неактивном состоянии. Важной особенностью металлопротеиназ является их спобосность к индукции под действием различных факторов. Регуляция активности коллагеназ осуществляется цитокинами, факторами роста, различными химическими соединениями (липополисахариды бактериального происхождения и др.), факторами, влияющими на мембрану клетки. Активность ММР подавляется тканевыми ингибиторами металлопротеиназ (TIMP), а также гормонами (глюкокортикостероиды и Т.П.) [2]. ММР-1 способна расщеплять три интерстициальных коллагена-типы I, II, III, которые существенно отличаются друг от друга. Более того, этот фермент гидролизует минорные коллагены типов VII и X, а также желатины разных коллагенов, белки соединительнотканного матрикса: энтактин, аггрикан и, кроме того, казеин, а2-макроглобулин и синтетические субстраты, которые по своей последовательности соответствуют гидролизируемой области в коллагене и а2-макроглобулине [4]. Ранее считалось, что главная роль в деструкции матрикса принадлежит ММР-1, затем была установле на и важная роль ММР-13, которая разрушает коллаген II типа, стромелизин и др. [6-9]. Известно, что в механизмах активизации металлопротеиназ значимую роль отводят сигнальным белкам S100A8 и A9. В результате, активируются NF-kB рецепторы синовиальных фибробластов, что определяет высвобождение многих цитокинов, таких как ИЛ-6, ИЛ-10, GM-CSF, IL-8 и хемоаттрактант моноцитов, который, в свою очередь, играет значимую роль в активации металлопротеиназ и обуславливает их высокую активность при остеоартрозе [6-9]. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Определить удельное число и интенсивность экспрессии ММР-1 и ММР-13 в гиалиновом хряще коленного сустава, сопоставить показатели активности протеиназ с морфометрическими параметрами суставного гиалинового хряща у крыс с экспериментальным остеоартрозом через 1 месяц с момента моделирования. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты выполнены на 20 половозрелых крысах линии Wistar, массой (250 ± 2,2) г. При работе с лабораторными животными соблюдены требования, изложенные в правилах лабораторной практики (GLP), «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных (1985), приказе МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 «Об утверждении правил лабораторной практики», Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977. Выпуск 1 (61). 2017 69 ЩШгорСз Лабораторные животные были распределены на 2 группы по 10 животных в каждой (контрольная и экспериментальная) (табл. 1). В экспериментальной группе 1 (контрольной) животным внутрисуставно вводили 0,5 мл 0,9%-й раствор NaCl. В экспериментальной группе 2 моделировали остеоартроз путем внутрисуставного введения 10%-й суспензии стерильного талька в том же объеме [3]. Таблица 1 Характеристика экспериментальных групп животных Порода животных Линия Wistar Возраст животных половозрелые Масса животных 250 + 2,2 г Вводимый ^'"^-■^препарат Группы 0,9%-й раствор NaCl 10%-я суспензия стерильного талька Экспериментальная № 1 0,5 мл однократно - Экспериментальная № 2 - 0,5 мл однократно тов мониторировали с помощью позитивных и негативных контролей антигенов, а также негативных кон-тролей антител. Характер иммуногистохимической реакции оценивали визуально в баллах с учетом интенсивности окраски (рис. 1) или определяли удельное количество позитивно окрашенных клеток стандартизированными методами морфометрии в иммуногистохимии с помощью системы анализа изображений (Петров С.В., Рай-хлин Н. Т., 2004; Dabbs D. J., 2010). Рис. 1. Визуально-аналоговая шкала для оценки интенсивности иммуногистохимической реакции по Allred D. C., et al. (1998) Все манипуляции у животных выполнялись после применения препарата «Рометар» по методике, описанной фирмой-производителем. Через 1 месяц после проведения манипуляций животных выводили из эксперимента путем введения смертельной дозы «Рометара», вычленяли левую бедренную кость для дальнейшего морфологического исследования. Хрящевую ткань с субхондральными отделами кости и синовиальной оболочкой фиксировали в 10%-м растворе нейтрального забуференного формалина (рН 7,4) в течение 24 часов (Newell K. J., et al., 2001). Проводили бескислотную декальцинацию в растворе ЭДТА (этилендиаминтетраацетат натрия) в стандартной концентрации. После полного удаления из костной ткани минерального компонента выполняли стандартную гистологическую проводку по спиртам возрастающих концентраций и препарат заключали в парафин. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином и по Маллори для качественной оценки структуры матрикса гиалинового хряща (Киясов А. П., 2001 ; Коржевский Д. Э., 2005). Для выявления экспрессии матриксных металло-протеиназ использовали первичные поликлональные антитела к MMP-1 (ABclonal, Китай) и MMP-13 (Almabion, Россия). Иммуногистохимическое исследование проводили в соответствии с протоколами фирм производителей антител с использованием систем детекции «UltraVision» (LabVision, Великобритания) и хромогеном - диаминобензидином, используя протокол высокотемпературной демаскировки антигенов в миниавтоклаве Pascal (DakoCytomation, Дания) (Kumar G.L., et al., 2009). Достоверность полученных результа Фотопротоколирование микроскопических изменений производили с использованием комплекса, включающего микроскоп «Axio Scope» (Carl Zeiss, Германия) и цифровую фотокамеру «Power Shot» (Canon, Япония). Морфометрический анализ проводили с помощью компьютерной программы «Видео ТестМор-фо-4» (Россия). Для оценки морфологичских показателей определяли толщину суставного хряща (L, мкм) и объемную долю хондроцитов по отношению к матриксу (ОД, %). Результаты экспериментов обрабатывались методами базисного статистического анализа на ПК с использованием программ «Видео ТестМорфо-4», Excel Microsoft Office (Microsoft, USA) и STATISTICA 6.0 (Stat Soft Inc., USA). Анализ параметров при нормальном распределении значений проводили с помощью критерия Стьюдента, анализ непараметрических количественных признаков - с помощью критерия Манна-Уитни. Для сравнения качественных признаков использовали критерии %2 и Фишера. Значимыми считали различия, если вероятность ошибки Р. < 0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Проведенное исследование показало, что в контрольной группе животных суставной гиалиновый хрящ имел толщину (330 ± 17,3) мкм и характерное гистологическое строение. Поверхностные хондроциты характеризовались уплощенной формой и располагались поодиночке в хрящевом матриксе. Хондроциты переходной и базальной зон имели округлую форму и располагались в составе изогенных групп рядами, ориентированными перпендикулярно к суставной поверхности. Объемная доля хондроцитов составляла (13,7 ± 1,1) % (табл. 2.). 70 Выпуск 1 (61). 2017 Таблица 2 Морфометрические параметры суставного гиалинового хряща у крыс контрольной группы и с экспериментальным остеоартрозом Экспериментальные группы Толщина, мкм. Объемная доля хондроцитов, % Экспериментальная группа № 1 330,0 ± 17,3 13,7 ± 1,1 Экспериментальная группа № 2 121,0 ± 20,4* 1,2 ± 0,6* ‘Достоверность различий по отношению к контрольной группе (Р. < 0,05). Морфологические признаки дегенеративно-дистрофических процессов не визуализировались (рис. 2а). Иммунохимическая реакция по Маллори выявляла равномерное расположение коллагеновых волокон, отсутствие очагов оссификации (рис. 3а). При проведении иммуногистохимического исследования удельное число хондроцитов, экспрессирующих ММР-1, составило (38 ± 2,1) %, а ММР-13 - (36 ± 4,2) % на фоне минимальной интенсивности экспрессии изучаемых металлопротеиназ (табл. 3), что соответствует малой скорости обновления компонентов матрик са в гиалиновом хряще при физиологическом ремоделировании. (рис. 4а, 5а). [6]. После моделирования остеоартроза происходило уменьшение толщины суставного хряща до (121 ± 20,4) мкм, Р. < 0,05 и снижение объемной доли хондроцитов до (1,2 ± 0,6) %, Р. < 0,05. Во всех зонах были отмечены множественные «пустые лакуны» и хондроциты с ка-риопикнозом, обширные участки деструкции суставной поверхности с разрастанием соединительной ткани, в толще которой определялось гранулематозное воспаление с выраженной гистиомакрофагальной инфильтрацией и гигантскими многоядерными клетками типа инородных тел, полнокровием кровеносных сосудов и неравномерным отеком межклеточного вещества (рис. 2б). При гистохимическом исследовании в суставном хряще отмечали неравномерность окрашивания коллагеновых волокон с выраженным нарушением тинкто-риальных свойств матрикса хрящевой ткани. В участках склероза волокна коллагена были окрашены наиболее интенсивно (рис. 3б). Иммуногистохимически у крыс с экспериментальным остеоартрозом резко возросло удельное число хон-дроцитов, экспрессирующих ММР-1 до (-73 ± 3,2) %, а ММР-13-до (95 ± 2,1) %, p < 0,05 (табл. 3) при одновременном максимальном усилении их экспрессии (рис. 4б, 5б). Таблица 3 Удельное число иммунопозитивных хондроцитов и интенсивнсть экспрессии ММР-1 и ММР-13 хондроцитов суставного хряща Экспериментальные группы Первичные антитела ММР-1 ММР-13 удельное число (%) интенсивность экспрессии удельное число (%) интенсивность экспрессии Экспериментальная группа № 1 38 ± 2,1 + 36 ± 4,2 + Экспериментальная группа № 2 73 ± 3,2* +++* 95 ± 2,1* +++* ‘Достоверность различий по отношению к контрольной группе (Р. < 0,05). а) б) Экспериментальная группа № 1 Экспериментальнаягруппа № 2 Рис. 2. Морфология гиалинового хряща у крыс экспериментальных групп (окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х 200) Выпуск 1 (61). 2017 71 ЩШгорСз а) Экспериментальная группа № 1 б) Экспериментальнаягруппа № 2 Рис. 3. Дегенеративно-дистрофические изменения гиалинового хряща у крыс экспериментальных груп (окраска по Маллори. Увеличение х 400) а) б) Экспериментальная группа № 1 Экспериментальнаягруппа № 2 Рис. 4. Иммуногистохимическая реакция с антителами к ММР-1 у крыс экпериментальных групп (увеличение х 400) а) б) Экспериментальная группа № 1 Экспериментальнаягруппа № 2 Рис. 5. Иммуногистохимическая реакция с антителами к ММР-13 у крыс экпериментальных групп (увеличение х 400) ЗАКЛЮЧЕНИЕ Таким образом, формирование выраженных дегенеративно-дистрофических процессов в гиалиновом хряще сопровождается резким увеличением удельного числа хондроцитов, экспрессирующих ММР-1 и, особенно, ММР-13 с максимальным усилением интенсивности их экспрессии. ЛИТЕРАТУРА

About the authors

S. A Demkin

Volgograd State Medical University

Email: smdem@mail.ru

D. A Malanin

Volgograd State Medical University

L. N Rogova

Volgograd State Medical University

G. L Snigur

Volgograd State Medical University

N. V Grigorieva

Volgograd State Medical University

K. V Baydova

Volgograd Medical Research Center

References

Supplementary files