IMMUNOPHENOTYPIC CHARACTERISTIC OF INTERCELLULAR COMMUNICATION OF INTACT KERATINOCYTES IN SEVERE SEPSIS

全文:

Сепсис остается одной из ведущих причин (клаудин-1, окклюдин) [2, 3]. Согласно проведен-смерти среди пациентов отделений реанимации ным исследованиям плотные контакты играют важи интенсивной терапии. Несмотря на прогресс ную роль в дифференцировке эпидермиса [11]. в изучении патогенеза системного воспаления В эксперименте на мышах с дефицитом клаи усовершенствовании методов терапии крити- удина-1 было выявлено выраженное нарушение ческих состояний, летальность при сепсисе со- эпидермального барьера, приводящее к обезвохраняется на неопределенно высоком уровне - живанию и гибели животных. Это объясняется 30-90 %. Отечественные и зарубежные клинико- мутацией в гене кодирующего клаудин-1, который эпидемиологические исследования описывают приводит к потере белка, что характерно для влияние значительного количества факторов ихтиоз а. При некоторых других кожных заболена течение и исходы сепсиса. ваниях также происходят структурные измене- Эмпирически установлено, что сепсис нару- ния белков и локализации плотных контактов. шает сохранность функций кожи и угнетает ее за- При псориазе отмечали увеличение экспрессии живление. Однако механизмы данных изменений окклюдина, ZO по сравнению со здоровой кожей [6]. мало описаны или носят гипотетический характер. Аналогичный эффект наблюдали при инфициро- В настоящем исследовании мы рассмотрим вании кожи патогенными бактериями [9]. Комбинароль межклеточных коммуникаций, а именно плот- торное или постмутационное действие окклюдина ных контактов, расположенных преимущественно и клаудина-1 изменяет функцию плотных контактов в поверхностных слоях эпидермиса и обеспечи- и усиливает эффект параклеточного барьера [5]. вающих вторичный барьер [13]. Несмотря на то, что существует определенное Данные межклеточные контакты образованы понимание возникающего дисбаланса белков межкомплексом трансмембранных и внутриклеточных клеточных коммуникаций при ряде инфекционных белков, которые располагаются непосредственно и других поражений кожи экзогенного происхождепод цитолемой и герметизируют субплазмолем- ния, но отсутствуют исследования возможных мальное пространство кератиноцитов шиповатого структурных перестроек этих белков на фоне (zonula occludens, ZO) и других слоев эпидермиса эндогенного поражения - при сепсисе, учитывая, что при этом происходит активная продукция и секреция интерлейкинов, оказывающих мутагенное действие на кератиноциты. ЦЕЛЬ РАБОТЫ Дать иммуногистохимическую оценку межклеточных коммуникаций (клаудин-1, окклюдин, ZO) эпидермиса при сепсисе. МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ Работу проводили на 40 архивных парафиновых блоках фрагментов кожи. На основании анамнестических, клинических и морфологических данных были сформированы две группы. I группа (n = 30) -аутопсийный материал кожи умерших пациентов с установленным патологоанатомическим основным диагнозом: тяжелый бактериальный сепсис, синдром полиорганной недостаточности согласно консенсусу ACCP/SCCM. Критерии включения: возрастной интервал 18-45 лет, клинически и морфологически верифицированные признаки гипоперфузии внутренних органов, повышение сывороточного лактата >4 ммоль/л, олигурия, нарушение сознания. Критерии исключения: беременность, установленное онкологическое заболевание, нозокомиальная этиология сепсиса, наследственные и приобретенные заболевания с поражением кожи и/или соединительной ткани (синдром Марфана, синдром Элерса - Данлоса, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, склеродермия, анкилозирующий спондилит, псориаз, фолликулярный гиперкератоз и др.), хроническое заболевание печени, хроническая почечная недостаточность, иммуносупрессивная и гормональная терапия, патология системы гемостаза в анамнезе. II группа (n = 10) - аутопсийный материал кожи контрольной группы пациентов, умерших по причинам, не связанным с инфекционным заболеванием. Критерии включения: возрастной интервал 18-45 лет, отсутствие клинически и морфологически верифицированных признаков гипоперфузии внутренних органов. Критерии исключения: перенесенный сепсис, беременность, установленное онкологическое заболевание, наследственные и приобретенные заболевания с поражением кожи и/или соединительной ткани (синдром Марфана, синдром Элерса - Данлоса, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, склеродермия, анкилози-рующий спондилит, псориаз, фолликулярный гиперкератоз и др.), хроническое заболевание печени, хроническая почечная недостаточность, иммуно-супрессивная и гормональная терапия, патология системы гемостаза в анамнезе. Иммуногистохимическое исследование проводили по стандартному протоколу в автоматическом режиме в иммуногистостейнере Bond-Max («Leica», Германия). Первичные антитела к клаудин-1 (Clone 2H10D10), окклюдин (Clone OC-3F10) и ZO (Clone R40.76); вторичные - универсальные антитела (HiDef Detection™ HRP Polymer system, «Cell Marque», США). Характер иммуногистохими-ческих реакций оценивали, используя полуколи-чественную шкалу по 3-балльной системе с подсчетом количества иммунопозитивных клеток в 10 случайно отобранных полях зрения светового микроскопа при увеличении *400 (в %): «-» отсутствие, «+» слабая (5-25 % клеток), «++» умеренная (25-50 % клеток), «+++» выраженная (>51 % клеток). Полученные образцы визуализировали на светооптическом микроскопе Leica DM 4000 B («Leica», Германия), совмещенном с видеокамерой и программным обеспечением. Полученные в результате подсчета данные обрабатывали с использованием компьютерной п рограммы SPSS 7.5 for Windows statistical software pa ckage (IBM Analytics, США). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Настоящее исследовании посвящено изучению плотных межклеточных контактов (клаудин-1, окклюдин и ZO) интактной кожи в условии системного воспаления. По данным литературы известно, что при сепсисе происходит функциональная перестройка плотных соединений. Так, в легких и кишке изменения структуры и локализации изучаемых белков приводят к нарушению барьерной функции, увеличению проницаемости (отеку) [8]. В печени изменяется локализация ZO и окклюдина, приводящая к гепатобилиарной дисфункции, сопровождаясь холестатической желтухой, а в почках наблюдали мутацию экспрессии гена ZO, проявляющуюся острой почечной недостаточностью [4]. Во всех исследуемых образцах кожи пациентов при сепсисе отмечали изменение имму-номечения (целостности) плотных межклеточных контактов по сравнению с контрольной группой (табл.). Результаты иммуногистохимических реакций с белками межклеточных коммуникаций в интактном слое эпидермиса при сепсисе (доля иммунопозитивных клеток, %) Белок Эпидермис при сепсисе (I группа) Здоровая кожа (II группа) Claudin-1 64,1 ± 1,1 87,2 ± 2,4 Occludin 18,3 ± 2,1 24,3 ± 1,8 ZO 19,5 ± 1,4 21,1 ± 2,5 Клаудин-1-позитивную мембранную ИГХ-реак-цию наблюдали во всех слоях эпидермиса, с уменьшением окрашивания от базального к зернистому слою: в I группе она была в 1,35 раза меньше, чем в здоровой коже (рис. 1). Во многих работах показана важнейшая роль клаудина-1 в регуляции эпидермального барьера, а уменьшение его концентрации сопровождается обезвоживанием и нарушением местного гомеостаза [7]. При сепсисе активируются провоспали-тельные цитокины (в первую очередь IL-1p и др.), которые снижают количество клаудина-1, и, как следствие, увеличивается доля макрофагов и автономная продукция IL-1p кератиноцитами, которые еще больше усиливают воспалительную инфильтрацию - то есть формируется «порочный круг». Кроме того, усилению локального воспаления способствует нарушение первичного и вторичного эпидермальных барьеров, а также нарушение дифференцировки кератиноцитов [12]. Напротив, на поздних стадиях системного воспаления наблюдается незначительное повышение клаудина-1, что оказывает компенсаторное действие, характеризующееся угнетением иммунной системой и снижением секреции цитокинов макрофагами [10]. Снижение интенсивности окрашивания отмечали с окклюдином, где в эпидермисе пациентов с сепсисом оно было уменьшено в 1,2 раза по сравнению с образцами контрольной группы (рис. 2). Обнаруженное уменьшение интегрального белка окклюдина, комбинаторно взаимодействующего с клаудином-1 для обеспечения эффективного параклеточного барьера, в условиях систем-ног о воспаления ослабляет межклеточный барьер и тем самым усиливает проницаемость интра-целлюлярного пространства [7, 14]. ЛоглрСа (ЩойглТОЩ): Положительная ИгХ-реакция на ZO была диффузной и практически тождественной в эпидермисе обоих групп (рис. 3). Диффузное иммуномечение ZO интактного эпидермиса при системном воспалении не показывает существенные изменения. Тем не менее, увеличение поляризации кератиноцитов приводит к нарушению его связывания с интегральными белками и образованию плотных соединений, о чем свидетельствуют проведенные ранее исследования [1]. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Снижение количества белков плотных соединений (клаудин-1, окклюдин, ZO), играющих важную роль в селективной проницаемости эпидермиса и контролирующих межклеточный поток биологически активных веществ, вызывает незначительные структурные изменения, проявляющиеся нарушением местного гомеостаза и эпидермальной барьерной дисфункцией.

作者简介

E. Shapovalova

S.I. Georgievsky Medical Academy of the FSAEI HE «Crimean Federal University named after V.I. Vernadsky»

G. Demyashkin

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University

Email: dr.dga@mail.ru

M. Malanichrev

S.I. Georgievsky Medical Academy of the FSAEI HE «Crimean Federal University named after V.I. Vernadsky»; Clinic of Plastic Surgery and Cosmetology «Frau Klinik»

D. Pogasyan

S.I. Georgievsky Medical Academy of the FSAEI HE «Crimean Federal University named after V.I. Vernadsky»; Clinic of Plastic Surgery and Cosmetology «Frau Klinik»

V. Shchekin

I.M. Sechenov First Moscow State Medical University

参考

补充文件