Method for assessing the efficiency of the use of a biological preparation in wastewater of oil extraction production

Full Text

Поиск, выделение и изучение возможности использования микроорганизмов для очистки жиросодержащих сточных вод начали наиболее активно проводить в 1970-1980-е гг. Активные исследования в этом направлении велись как в странах бывшего Советского Союза, так и за рубежом [1–5]. Наиболее глубоким исследованием в этот период были подвергнуты бактерии рода Bacillus, Pseudomonas и дрожжи Yarrowia. В 1990 г. расширение поиска микроорганизмов для очистки сточных вод способствовало вовлечению исследователями в список липолитических активных культур микроорганизмов родов Chromobacter, Microccus, Acinetobacter, Rhodococus [4, 6, 7]. Существенный интерес к изучению липолитической активности микроорганизмов Serratia marcescens объясняет пристальное внимание исследователей к данным штаммам благодаря их способности синтезировать продигиозин [8]. С 2000-х гг. и по настоящее время данная культура изучается преимущественно в качестве продуцента липазы [9, 10].

К числу основополагающих технологических характеристик микроорганизмов, используемых для очистки жиросодержащих сточных вод, относится их деструктивная активность, направленная на разрушение липидов до углекислого газа и воды. Наиболее важную роль в процессе распада органических веществ играют ферменты-биокатализаторы, образующиеся в клетке и представляющие собой либо простые белки, либо сложные, содержащие не аминокислотные компоненты [11, 12]. В частности распад нейтральных липидов происходит за счет гидролитического действия липаз. Результатом является образование глицерина и жирных кислот.

Анализ литературных источников показывает, что изучение деструкции ведется как в отношении растительных масел (подсолнечное, оливковое, пальмовое, рапсовое), так и жиров животного происхождения (говяжий, свиной, бараний).

Липазы являются ферментами, синтез которых зависит от скорости роста и развития продуцента, его биосинтетической способности. Как показали многолетние исследования, для каждого штамма свойственны свои оптимальные условия культивирования, включающие компоненты питательной среды (источники углерода, азота, присутствие липидов, неорганические соли) и физико-химические факторы процесса ферментации (температура, PH среды, режим перемешивания и аэрации) [13, 14].

Возможность применения липолитически активных культур, обладающих деструктивной способностью и субстратной специфичностью к жирам в сточных водах пищевых производств, отображена в работах [15–17]. При подборе наиболее активных штаммов и поддержании определенных условий очистки эффект мог бы достигать 80–90 %.

Предмет исследования

Исследования проводились на территории маслоэкстракционного завода в г. Безенчук Самарской области в течение 18 дней.

Эксперимент по определению деструктивной активности микроорганизмов на сточных водах с высоким содержанием жиров, нефтепродуктов и фенольных примесей был осуществлен с помощью биопрепарата «Русский богатырь № 4». Источником триглицеридов служили отобранные пробы сточных вод маслоэкстракционного завода, поступающие на модельную установку, и очищенные сточные воды. Доза введенного препарата составила 6,25 мг/л. Время пребывания в аэрационном сооружении составляло 50–60 мин, отбор контрольных проб производился каждый день работы установки.

Объектом исследования служили пробы сточных вод маслоэкстракционного завода, объем каждого образца составлял 1,5 л, из которого бралась аликвота для определения исследуемых показателей в соответствии с методикой эксперимента. Все исследования выполнены в двух повторах на один образец.

Материалы и методы

Определение содержания триглицеридов в сточных водах проводили в лабораторных условиях с применением методики по определению нейтральных жиров.

Принцип метода заключается в том, что триглицериды экстрагируются смесью гептана и изопропилового спирта, в которую переходят только неполярные липиды. Триглицериды гидролизуются щелочью, глицерин окисляется йодной кислотой до формальдегида, который определяется по цветной реакции с ацетилацетоном.

Далее требуется внести во флакон с завинчивающейся тефлоновой крышкой навеску сухой измельченной ткани, доведенной до постоянной массы (25–30 мг). Добавить 3,5 мл изопропилового спирта и 2 мл гептана. Интенсивно встряхнуть и поставить в термостат при температуре 37 °С на ночь. На следующий день добавить в каждый флакон 0,5 мл воды и 1,0 мл 0,16 М раствора серной кислоты. Закрыть флакон крышкой, интенсивно встряхнуть, смесь перелить в центрифужную пробирку и центрифугировать 15 мин при 1500 об/мин. Из верхнего (гептанового) слоя отобрать 0,4 мл и перенести в стеклянную мерную пробирку со шлифом и притертой пробкой. Добавить 2,0 мл изопропилового спирта и 40 мкл 6,25 М раствора КОН. Перемешать, закрыть пробкой и нагреть на водяной бане 10 мин при температуре 70 °С. После охлаждения добавить 0,2 мл раствора йодной кислоты и 1 мл ацетилацетонового реактива. После перемешивания снова закрыть пробкой и нагревать еще 10 мин при 70 ºС. Развивается желто-зеленое окрашивание, интенсивность которого измеряют, фотометрируя образцы при длине волны 425 нм в кюветах с длиной оптического пути 0,5 см против контрольной пробы, которую ставят так же, как и опытную, но без навески исследуемого материала.

Определение содержания триглицеридов проводили с использованием калибровочного графика, построенного по стандартному раствору. 20,4 мг топленого животного жира растворяли в 1 мл изопропилового спирта.

Проба № 1. В стеклянную мерную пробирку со шлифом внести 200 мкл калибровочного раствора, добавить 3,3 мл изопропилового спирта (4,08 мг жира).

Проба № 2. К 100 мкл калибровочного раствора добавить 3,4 мл спирта (2,04 мг жира).

Проба № 3. К 50 мкл калибровочного раствора добавить 3,45 мл изопропилового спирта (1,02 мг жира).

Проба № 4. Отобрать 25 мкл калибровочного раствора и внести 3,48 мл спирта (0,51 мг триглицеридов).

Проба № 5. Включает 12,5 мкл калибровочного раствора и 3,50 мл изопропилового спирта (0,255 мг).

Калибровочные пробы обрабатываются так же, как и экспериментальные. Расчёт результатов проводился по калибровочной кривой.

Определение содержание триглицеридов проводили с использованием калибровочного графика, построенного по стандартному раствору. 20,4 мг топленого животного жира растворяли в 1 мл изопропилового спирта.

Расчет триглицеридов производился по формуле

${С}_{оп}=\left(0,816·\frac{{Е}_{оп}-{Е}_{к}}{2,10}\right)·5·20$, (1)

где С_оп – концентрация триглицеридов в исследуемом образце, мг/л;

0,816 мг – одержание триглицеридов в пробе стандарта (0,4 мл из 2 мл гептана, стандартный р-р 4,08 мг);

Е_оп – оптическая плотность опытной пробы;

Е_к – средняя оптическая плотность контроля, 0,126 ед;

2,10 – средняя оптическая плотность стандарта (0,816 мг/пробу) с вычетом оптической плотности контроля;

5 – коэффициент пересчета (так как по методике в пробу берется 0,4 мл из 2 мл гептана);

20 – коэффициент пересчета на 1 л (так как выпаривается 50 мл).

Для определения активности фермента использовали набор «ЛИПАЗА» (LPS) («ДиаВетТест», Россия) для полуавтоматических анализаторов, адаптировав для определения в пробах сточных вод.

Расчет активности липазы производили по формуле

$А=154·\frac{∆Еоп-∆Ек}{∆Ест-∆Ек},$(2)

где А – активность липазы, Е/л;

154 – активность липазы в стандартной сыворотке, Е/л;

(∆Е_оп – ∆Е_к) – разница оптической плотности опытной и контрольной проб;

(∆Е_ст – ∆Е_к) – разница оптической плотности стандартной и контрольной проб.

Данные, полученные при применении данного метода, позволят оценить интенсивность развития углеводородокисляющих микроорганизмов, а также биодеградации в отношении конкретных веществ, что позволит утверждать о возможности биохимической очистки сточных вод биопрепаратом.

Результаты

Зависимость оптической плотности раствора от концентрации триглицеридов, представленная на калибровочном графике, построенном по стандартам с концентрациями от 0,255 до 4,08 мг на пробу, носила прямолинейный характер (см. рисунок).

 

График зависимости оптической плотности раствора от содержания триглицеридов

 

Из полученных результатов видно (см. таблицу), что содержание триглицеридов в образцах составило от 2,72 мг/л в пробе №8 до 95,55 мг/л в пробе №5. Пик деструктивной активности приходился на 3–6-е сутки, через трое суток – 73,62 %, через 5 суток – 22, 66 %, на 7-е и 9-е сутки – концентрация загрязнений была незначительной, снижение на 81,16–96,96 %.

 

Концентрация триглицеридов и активность липазы в образцах сточных вод

№ пробы	Концентрация триглицеридов в исходной воде, мг/л	Активность липазы в исходной воде Е/л	№ пробы	Концентрация триглицеридов после введения биопрепарата, мг/л	Активность липазы после введения биопрепарата Е/л
1	90,54	0,00	2	90,15	0,00
1´	91,16	0,00	2´	90,54	0,00
3	42,74	4,53	4	12,51	9,06
3´	43,29	13,59	4´	11,42	13,59
5	95,55	0,00	6	68,16	0,00
5´	94,62	0,00	6´	66,33	4,53
7	89,48	2,43	8	2,72	69,06
7´	90,55	7,34	8´	2,80	77,00
9	10,69	4,53	10	1,94	9,06
9´	11,15	13,59	10´	2,10	13,59

 

Липолитическая активность в образцах сточных вод составила от 0,00 до 77,00 Е/л, наиболее активный рост зафиксирован на 5-е сутки после введения разовой дозы биопрепарата 6,25 мг/л.

Выводы. 1. Перспективным направлением является разработка технологии биологической очистки жиросодержащих сточных вод с помощью микроорганизмов, обладающих липолитической активностью и способных утилизировать жировые вещества различной природы.

2. Под действием микроорганизмов биопрепарата, в исследуемых пробах сточных вод была определена динамика изменения концентрации триглицеридов от 2,72 до 95,55 мг/л, липолитическая активность – от 0,00 до 77,00 Е/л, что свидетельствует о биодеградации загрязняющих веществ в сточных водах маслоэкстракционного завода г. Безенчук Самарской области.
3. Полученные результаты могут служить дополнительным инструментом для внедрения новых методов контроля сточных вод предприятий пищевой промышленности.

About the authors

Alexander K. Strekkov

Samara State Technical University

Email: a19400209@yandex.ru

Doctor of Engineering Science, Head of the Water Supply and Wastewater Chair

Russian Federation, 443100, Samara, Molodogvardeyskaya str., 244

Anastasya O. Bazarova

Samara State Technical University

Email: bystranova14@mail.ru

Postgraduate Student of the Water Supply and Wastewater Chair

Russian Federation, 443100, Samara, Molodogvardeyskaya str., 244

Svetlana Yu. Teplyh

Samara State Technical University

Author for correspondence.
Email: kafvv@mail.ru

PhD in Engineering Science, Associate Professor the Water Supply and Wastewater Chair

Russian Federation, 443100, Samara, Molodogvardeyskaya str., 244

References

Supplementary files