Phytoremediation potential of aquatic plants to tetracycline in Eastern Siberia

Full Text

Введение

В условиях пандемии Covid 19 практически неконтролируемое на законодательном уровне использование антибиотиков в медицине в процессах самолечения населения, а также в сельском хозяйстве с целью повышения продуктивности животных и птиц в животноводстве, птицеводстве, аквакультуре создало серьезные экологические проблемы фармацевтического мусора и его нового аспекта – антибиотикоустойчивости патогенных микроорганизмов. По данным многочисленных исследований установлено, что практически все объекты окружающей среды: поверхностные воды, почвы, пищевые продукты растительного и животного происхождения в той или иной степени загрязнены антибиотиками [1–13].

В настоящее время в ветеринарии и медицинской практике наиболее распространенными и часто применяемыми являются тетрациклины, пенициллины и аминогликозиды [14–16].

Эти антибиотики чаще других используются в качестве кормовых добавок и способствуют быстрому росту животных и птиц и получению товарной продукции, а следовательно, их применение экономически выгодно для сельхозпроизводителей продукции животного происхождения. Тетрациклины широко применяются не только на крупных фермах и птицефабриках, но и домашних подворьях. Среди ветеринарных антибиотиков именно производство и потребление тетрациклинов занимает ведущее положение. Окситетрациклин и хлортетрациклин получили большое распространение в качестве стимуляторов роста [17], а окситетрациклин – в пчеловодстве и аквакультуре.

Передозировка данных препаратов обусловливает их накопление в продуктах питания, и необходим жесткий контроль остаточного содержания антибиотиков в товарной продукции. В настоящее время установлены нормативы Евросоюза, регламентирующие остаточное содержание в продуктах, а именно максимально допустимые уровни содержания тетрациклина, окситетрациклина и хлортетрациклина в молоке, мясе, субпродуктах и яйцах. Допустимые концентрации варьируются в диапазоне от 0,1 до 0,6 мг/кг для разных продуктов [18].

Остаточное содержание тетрациклина и его производных в молоке, мясе, птице, яйцах и мёде согласно российским нормативам должно быть менее 0,01 мг/кг (сумма исходных веществ и их 4-эпимеров) [19]. ПДК для доксициклина в мясе и субпродуктах варьируются от 0,1 до 0,6 мг/кг [20].

Законодательно нерегламентированное потребление тетрациклинов приводит к серьезным проблемам со здоровьем потребителей загрязненных продуктов питания, а именно к эндокринным нарушениям, хронической интоксикации и развитию устойчивых к антибиотикам микроорганизмов, создает сложности лечения инфекционных заболеваний у людей, экономическим потерям и требует создания новых поколений антибиотиков.

Для всех тетрациклинов характерен широкий спектр антимикробного действия. Они высокоактивны в отношении большинства грамположительных и грамотрицательных бактерий. Механизм антибактериального действия тетрациклинов связан с подавлением белкового синтеза (блокада функции рибосом). Штаммы, устойчивые к тетрациклинам, чаще обнаруживаются среди стафилококков и возбудителей желудочно-кишечных инфекций (эшерихий и сальмонелл). Большинство грамположительных микроорганизмов чувствительны к тетрациклинам в концентрации 1 мкг/мл и менее, большинство грамотрицательных – в концентрации 1–25 мкг/мл.

Общее потребление тетрациклина в Европе, в том числе в России, за 2016-2018 гг. составило четверть от всех использованных антибиотиков [21]. Потребление антибиотиков в России в 2015 г. по данным ВОЗ находилось на среднем уровне и составило 14,82 определенных суточных доз на 1000 человек. Исходя из этой оценки в течение года в стране было использовано 915,65 т противомикробных препаратов [22].

Плохо контролируемое употребление тетрациклинов приводит к их накоплению в объектах окружающей среды и созданию проблем фармацевтического мусора. В частности показано, что хлортетрациклин, накапливающийся в почве, оказывает токсичное действие на репродуктивные функции дождевых червей Eisenia fetida, его биохимические реакции – активности каталазы, супероксиддисмутазы и глутатион-S-трансферазы [23]. Этот антибиотик оказывает токсичное действие на рост кукурузы и образование активных форм кислорода [24], особенно опасен на ранних стадиях развития растений. Окситетрациклин влияет на ферментативную активность почвенных микроорганизмов при концентрациях более 15 мг/кг [25]. При исследовании воздействия окситетрациклина на пшеницу установлено, что он может ингибировать удлинение побегов и корней, EC₅₀ = 65,5 мг/л и 34,7 мг/л соответственно [26].

Появились научные публикации, где исследовалась способность не только микроорганизмов, но и растений поглощать и подвергать окислительной деградации тетрациклины и осуществлять процесс фиторемедиации. В частности доказаны фиторемедиационные свойства цветковых растений Mirabilis jalapa и Tagetes patula L кумулировать кадмий и тетрациклины из загрязненных почв. Эффективность удаления тетрациклина всех обработок была выше 99 %, эти цветочные растения, по мнению авторов, являются перспективными гипераккумуляторами, которые могут быть использованы для восстановления щелочной почвы, совместно загрязненной Cd и тетрациклином [27]. Изучена способность растения Cicer arietinum (черный горох) снижать концентрацию тетрациклина в почве в 2,5 раза в течение 21 дня, авторы утверждают, что это растение перспективно для создания технологии фиторемедиации загрязненных почв, так как токсичный эффект не фиксировался при концентрациях тетрациклина до 0,225 мг/мл [28].

Опробована технология извлечения тетрациклина травой ветивера. Установлено, что в зависимости от начальных концентраций и времени при выращивании травы в течение 60 сут в загрязненной гидропонной установке, полное удаление тетрациклина происходит по прошествии 40 сут при всех испытанных концентрациях. При этом тетрациклин накапливается в корнях, а затем перемещается в ткани побегов [29].

Водные растения Myriophyllum aquaticum (перо попугая) и Pistia stratiotes (водяной салат) использовались для изучения фиторемедиации тетрациклина и окситетрациклина из водных сред. Установлено, что происходит модификация тетрациклина в водной среде, так как отмечается изменение спектральных характеристик растворов. Кинетический анализ исключает прямой ферментативный катализ; скорость модификации снижалась с увеличением безрецептурных концентраций [30].

При оценке потенциала тростника обыкновенного (Phragmites australis) удалять ветеринарные препараты (энрофлоксацин, цефтиофур, тетрациклин) их водных сред установлено, что эффективность очистки колеблется в диапазоне 75–94 %. При этом в процессе удаления не участвуют микроорганизмы. Основную функцию выполняют корни растений. Предложено осуществлять посадки P. australis для удаления фармацевтических препаратов из сточных вод животноводческой фермы и скотобойни [31].

Технологии фиторемедиации загрязненных вод с использованием очистительных функций водных растений исследуется учеными разных географических широт с учетом их особенностей. В настоящее время во многих странах широкое применение находят специально построенные водно-болотные угодья в качестве дополнительного этапа очистки после очистных сооружений [32].

На Тайване на построенных водно-болотных угодьях Вулуо детально исследованы процессы очистки от 13 ветеринарных антибиотиков, в том числе тетрациклинов, сульфонимидов, хлорамфениколов, фторхинолонов и красителей в концентрациях до 552 нг/л. Эффективность удаления антибиотиков варьировали в диапазоне от 43 до 87 % в зависимости от его химической структуры. Остаточное содержание тетрациклина, хлортетрациклина, сульфамеразина, сульфаметазина и красителей: малахитовый зеленый и лейкомалахитовый зеленый после очистки было ниже пределов обнаружения во всех образцах [33].

Из-за недостаточного внимания проблемам фармацевтического мусора в регионах с резко континентальным климатом, свойственным Восточной Сибири, неосведомленности общественности и постоянного неконтролируемого их поступления в окружающую среду в Байкальском регионе возникла серьезная экологическая проблема загрязнения объектов среды обитания антибиотиками. Имеющиеся очистные сооружения, как правило, не обеспечивают удаление антибиотиков из сточных вод, и они транзитом проходят через систему очистки и поступают непосредственно в водные объекты (реки, озера) и создают угрозу водопользователям, расположенным ниже по течению реки. Препятствием на пути распространения антибиотиков могут стать системы доочистки в виде фито-инженерных очистных сооружений с посадками водных растений, обладающих высоким фиторемедиационным потенциалом к антибиотикам [34–36].

Целью настоящей работы являлась оценка фиторемедиационного потенциала водных растений, произрастающих в условиях Восточной Сибири, к антибиотикам на примере тетрациклинов.

 

Рис. 1. Циклические структуры антибиотиков: Тетрациклин: R1=R3=H, R2=OH; Окситетрациклин: R1=H, R2=R3=OH. Хлортетрациклин: R1=Cl, R2=OH, R3=H; Доксициклин: R1=R2=H, R3=OH

 

Объекты и методы исследования

В работе использовали тетрациклин, полученный из аптечной сети. Антибиотики тетрациклиновой группы представляют собой полифункциональные гидронафтаценовые соединения, состоящие из четырех циклических структур:

Фиторемедиационный потенциал водных растений оцeнивали в условиях лабораторного моделирования.

На первом этапе исследования выполнили фитотестирование тетрациклина по ростовым реакциям водного растения – элодея канадская, рекомендованного в качестве тест-объекта в водной токсикологии. Тестирование проводили по следующей схеме: растения отбирали в р. Ангаре, выбирали верхушечную часть побегов длиной 5 см, помещали по 10 штук в колбы с 500 мл исследуемого раствора тетрациклина заданной концентрации и выдерживали в лаборатории определенное время при комнатной температуре. Через 3–7 сут измеряли длину побегов и оценивали прирост в процентах к контролю.

Исследования по оценке фиторемедиационного потенциала водных растений, произрастающих в Ангаре, проводили по следующей схеме. Растения собирали тралом, освобождали от грунта, промывали и культивировали в лаборатории в аквариумах с дехлорированной водой при умеренном освещении и температуре 14–16 °С. Объектами исследований были: элодея канадская (Elodea сanadensis), уруть мутовчатая (Myriophyllum spicatum), роголистник темно-зеленый (Ceratophyllum demersum).

В колбы вместимостью 500 мл помещали навески водных растений из расчета 1–10 г/л, заполняли водой с заданными концентрациями тетрациклина и выдерживали в термолюминостате при освещенности 2–2,5 тыс. лк при температуре от 18 до 20 °С. Через определенные промежутки времени отбирали пробы и анализировали остаточное содержание тетрациклина. Во всех исследованиях параллельно ставили контрольные эксперименты: растворы тетрациклина без растений, с растениями, предварительно термообработанными или стерилизованными 0,1 %-м раствором сулемы (с последующей промывкой дистиллированной водой).

Для контроля концентрации тетрациклина в испытуемых растворах использовали спектрофотометр Shimadzu 1800. Тетрациклин в нейтральной среде имеет УФ-полосу поглощения с максимумом в области 360 нм (1 на рис. 2, а), обусловленную электронной структурой молекулы, образованной из четырех конденсированных ароматических колец и заместителей при них. В сильнощелочной среде происходит изомеризация тетрациклина с образованием окрашенных в желтый цвет изомеров с максимумом УФ поглощения при 380 нм (2 на рис. 2, а). Эта реакция используется для идентификации и спектрофотометрического количественного определения тетрациклина.

 

Рис. 2. Контроль концентрации тетрациклина в испытуемых растворах: а – полосы УФ поглощения тетрациклина; б – градуировочный график для количественного определения тетрациклина

 

Через 1, 2, 3, 6, 9 и 18 сут отбирали пробы, фильтровали через фильтр «синяя лента», доводили рН раствора до щелочной среды (рН=9.0) и оценивали остаточную концентрацию тетрациклина по УФ поглощению при 380 нм по градуировочному графику (рис. 2, б).

Физиологическое состояние водных растений оценивали по движению протоплазмы, хлоропластов, внешнему виду растений и содержанию хлорофилла и активности ферментов из класса оксидоредуктаз.

Результаты и их обсуждение

При оценке воздействия на ростовые реакции водного растения Elodea Canadensis установлено, что в области исследованных концентраций от 5 до 30 мг/л наблюдается стимулирование роста побегов элодеи по сравнению с контролем в условиях хронического эксперимента (рис. 3). Только при концентрациях 60 мг/л и более отмечается ингибиторный эффект, следовательно, водные растения способны элиминировать тетрациклин.

 

Рис. 3. Прирост побегов элодеи канадской в растворах тетрациклина

 

Экспериментально установлено, что в присутствии исследуемых водных растений происходит более интенсивное снижение содержания тетрациклина в растворе по сравнению с контролем. Как видно из данных, приведенных на рис. 4–6, все исследованные водные растения эффективно удаляют (элиминируют) тетрациклин из раствора. Через 13–18 сут водные растения удаляют до 65–80 % антибиотика от исходного. В контрольных опытах без растений или в опытах с растениями, предварительно инактивированными кипячением, наблюдается значительно менее интенсивное снижение содержания тетрациклина (на 40–50 % от исходного уровня).

 

Рис. 4. Изменение концентрации тетрациклина в водных растворах в присутствии водных растений при исходной концентрации тетрациклина 5 мг/л

 

Рис. 5. Изменение концентрации тетрациклина в водных растворах в присутствии водных растений при исходной концентрации тетрациклина 10 мг/л

 

Рис. 6. Изменение концентрации тетрациклина в водных растворах в присутствии водных растений при исходной концентрации тетрациклина 30 мг/л

 

Процесс элиминирования тетрациклина описывается уравнением первого порядка, константы скорости этого процесса приведены в табл. 1. В настоящем исследовании под элиминированием понимается вся совокупность процессов, приводящих к уменьшению содержания тетрациклина во внешнем растворе и включающих как поглощение растениями, так и метаболизм под действием ферментных систем растений.

 

Таблица 1. Константы скорости элиминирования тетрациклина (К, сут-1) водными растениями для разных исходных концентраций (фитомасса растений 10 г/л; температура 18±2 °С; рН = 6,8)

Условия опыта	Исходная концентрация тетрациклина, мг/л
	5	10	30
В природной воде без растений	0,110±0,046	0,059±0,024	0,041±0,023
В природной воде с растениями, инактивированными кипячением	0,098±0,052	0,052±0,027	0,040±0,026
С элодеей канадской	0,218±0,038	0,088±0,025	0,235±0,046
С роголистником темно-зеленым	0,320±0,064	0,061±0,031	0,242±0,061
С урутью мутовчатой	0,440±0,094	0,207±0,077	0,442±0,106

 

Из всех исследованных растений наибольшая скорость элиминирования характерна для урути мутовчатой при всех исходных концентрациях тетрациклина.

Установлено также, что с увеличением фитомассы растений при исходной концентрации 10 мг/л начальные скорости элиминирования возрастают. Эта зависимость описывается линейным уравнением У = 0,142 Х + 0,356 с коэффициентом корреляции R=0,99.

Биохимическая природа элиминации в случае элодеи канадской подтверждается линейной зависимостью начальных скоростей элиминирования в экспериментах с гомогенатами элодеи и ферментными препаратами, полученными при промывке ацетоном, в частности пероксидазой. Ранее совместно с учеными из Грузии нами были впервые выделены и изучены свойства пероксидазы из элодеи канадской [37].

При изучении методом гель-фильтрации было установлено, что в элодее имеются пероксидазы с молекулярными массами 94000, 67000, 56000 и 48900. Оптимум рН низкомолекулярной фракции пероксидазы 5,6–6,2, а высокомолекулярной – рН 4,1–5,0. Следовательно, в процессе элиминирования тетрациклина возможно участие пероксидаз в широком диапазоне рН.

На основании экспериментальных данных был рассчитан фиторемедиационный потенциал водных растений по тетрациклину для разных исходных концентраций антибиотика (табл. 2).

 

Таблица 2. Фиторемедиационный потенциал водных растений к тетрациклину, мг/г сырого веса

Время экспозиции, сут	Исходная концентрация тетрациклина, мг/л
	5			10			30
	Элодея	Уруть	Роголистник	Элодея	Уруть	Роголистник	Элодея	Уруть	Роголистник
1	0,10	0,18	0,14	0,08	0,19	0,06	0,32	0,57	0,34
3	0,15	0,26	0,20	0,20	0,36	0,21	0,74	1,12	0,84
6	0,22	0,32	0,26	0,40	0,55	0,31	1,49	1,68	1,54
18	0,34	0,32	0,38	0,63	0,64	0,73	2,19	2,16	2,39

 

Согласно полученным результатам, для всех исходных концентраций антибиотика в первые 6 сут максимальную поглощающую активность проявляет уруть мутовчатая, а через 18 сут возрастает фиторемедиационный потенциал роголистника.

Заключение

Сравнив результаты собственных исследований с литературными данными [38] по извлечению противовоспалительных препаратов растениями Scirpus validus и Typha angustifolia, можно сделать вывод, что эффективность извлечения тетрациклина элодеей канадской, урутью мутовчатой и роголистником темно-зеленым соизмерима с этими растениями и достигает 11–85 %. Максимальная скорость элиминирования тетрациклина из воды установлена для урути мутовчатой. Рассмотренные растения демонстрируют адаптивные свойства в условиях тетрациклинового загрязнения. Очевидно, в них формируются реакции, направленные на усвоение или обезвреживание антибиотика. Полученные результаты позволяют рассматривать фиторемедиацию погруженными водными растениями как одно из недорогих решений удаления антибиотиков из водной среды. Необходимо продолжить исследования по созданию гибких фитоинженерных систем для очистки объектов окружающей среды от ветеринарных антибиотиков. В условиях Восточной Сибири работа фиторемедиационных сооружений может обеспечиваться в полном объеме только при положительных температурах. Предполагаемая длительность работы сооружений в году приравнивается к длительности формирования поверхностных стоков и составляет примерно 58 %.

About the authors

Svetlana S. Timofeeva

Irkutsk National Research Technical University

Author for correspondence.
Email: sstimofeeva@mail.ru

Doctor of Engineering Science, Head of the Industrial Ecology and Life Safety Chair

Russian Federation, 664074, Irkutsk, Lermontova str., 83

Olga V. Tyukalova

Irkutsk National Research Technical University

Email: olgaburlak1@yandex.ru

PhD in Chemistry, Associate Professor of the Industrial Ecology and Life Safety Chair

Russian Federation, 664074, Irkutsk, Lermontova str., 83

Dmitrii V. Ulrikh

South Ural State University

Email: ulrikhdv@susu.ru

Doctor of Engineering Science, Associate Professor, Director of the Institute of Architecture and Construction

Russian Federation, 454080, Chelyabinsk, Lenin av., 76

References

Supplementary files