Intraportal therapy of autologous bone marrow mononuclear cells in patients on the waiting list for liver transplantation

Abstract


This study was carried out to explore the methodology of intraportal infusion of autologous bone marrow mononuclear cells in patients in the waiting list for liver transplantation. The study included eight patients. The Model for End-Stage Liver Disease (MELD) score as a predictor of hepatic failure exceeds 10 points, i.e., 12-22 points. According to Child-Turcotte-Pugh (CTP) classification, the severity of cirrhosis ranged from class B to C. The bone marrow volume of 224-320 ml was harvested by bilateral aspiration from the posterior iliac crest. The total volume of the mononuclear cells (MNC) was 47.1-58.3 ml (median, 47 ml). The absolute viable count of isolated MNC was 1.24 · 109-5.84 · 109 and CD34+ cells 2.54 · 106-48.20 · 106. After portal vein catheterization, direct transhepatic portography was performed, and portosystemic collaterals were found in all cases. Portal flowmetry was performed to determine the optimal selective perfusion rate of the segmental branches of the portal vein. Portal vein infusion was performed at 0.3-1.5 ml/sec. Serious side effects were not detected during bone marrow harvesting and MNC infusion. All patients had stable condition (no deterioration was initially noticed) after MNC infusion according to the MELD score and CTP criteria during a 3-month observation. Moreover, improvement in physical health status was observed and obtained using the SF-36 questionnaire. This study confirmed the safety of using intraportal therapy of autologous bone marrow MNC in patients on the waiting list for liver transplantation. Herein, we presented the technique of target delivery of autologous bone marrow MNC to the liver to minimize their loss during intraportal infusion. Prolonged follow-up time and improvement of the present technique are needed for further evaluation of the efficiency of autologous bone marrow MNC.

Full Text

Введение В настоящее время единственным радикальным способом лечения цирроза печени (ЦП) является трансплантация печени (ТП). Отсутствие эффективных лекарственных препаратов, повышающих синтетическую функцию печени у пациентов с различной степенью выраженности печеночной недостаточности, стимулирует разработку новых технологий терапии для пациентов с терминальной стадией заболевания печени. В эксперименте как in vitro, так in vivo были показаны регенеративные способности мезенхимных и гемопоэтических клеток костного мозга человека [7, 13]. Немногочисленные исследования демонстрируют определенную эффективность применения аутологичных клеток костного мозга при хронической печеночной недостаточности, однако их результаты не однозначны [3, 8, 10, 12]. В процессе терапии стволовыми клетками костного мозга человека перед исследователями возникают три главных вопроса: способ получения стволовых клеток, путь введения-доставки, а также выбор популяции клеток, обеспечивающих лучший терапевтический эффект при хронической печеночной недостаточности. Данная работа посвящена исследованию особенности методики внутрипортального введения мононуклеарных клеток (МНК) аутологичного костного мозга человека у пациентов из листа ожидания ТП. Материалы и методы исследования Отбор пациентов Исследование было одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ «РНЦРХТ им. акад. А.М. Гранова» Минздрава РФ в 2015 г. Пациентов отбирали согласно разработанным нами критериям включения и исключения. Основные критерии включения: наличие хронической печеночной недостаточности, ожидаемая продолжительность жизни больного не меньше 3 мес., возраст старше 18 лет, сохраняемая дееспособность. Основные критерии исключения: клинически доказанные признаки первичного и вторичного злокачественного новообразования печени, злокачественное новообразование других локализаций, наличие вируса иммунодефицита человека, вируса гепатита и признаки активной бактериальной инфекции. У всех отобранных больных получено добровольное информированное согласие для участия в исследовании с описанием процедуры лечения. В исследование были включены 8 пациентов (4 женщины и 4 мужчин) в возрасте от 44 до 60 лет из листа ожидания ТП ФГБУ «РНЦРХТ им. акад. А.М. Гранова» Минздрава России: два пациента с ЦП вследствие первичного билиарного холангита, 6 пациентов с ЦП вследствие неверифицированного гепатита. Показатель печеночной недостаточности по шкале MELD превышал 10 баллов (от 12 до 22 баллов), а тяжесть печеночной недостаточности по критерию Child-Turcotte-Pugh соответствовала классам B и С (табл. 1). Обследование пациентов У всех потенциальных кандидатов до включения в исследование проводили лабораторные исследования крови и мочи, определяли маркеры АФП, С19-9, РЭА, ПСА (у мужчин) в сыворотке крови; исключали вирусные заболевания: вирусные гепатиты, ВИЧ, бактериальные инфекции, в том числе сифилис. Оценивали интегральные показатели MELD, Child-Turcotte-Pugh, качество жизни пациентов при помощи опросника SF-36, выполняли мультиспиральную компьютерную томографию органов грудной клетки и брюшной полости с внутривенным контрастным усилением, ультразвуковую эластометрию печени. После включения в исследования до введения МНК аутологичного костного мозга производили кор-биопсию печени с последующим гистологическим и иммуногистохимическим исследованием маркерами АФП, Ki67. Получение костного мозга После госпитализации пациентов в клинику центра в первой половине дня в условиях операционной под местной анестезией и мониторингом основных витальных функций выполняли забор костного мозга методом билатеральной трепан-аспирации из заднего гребня подвздошной кости (рис. 1). Для забора костного мозга использовали набор для биопсии костного мозга 14G × 70 mm (BBL SC, TSUNAMIMEDICAL, Италия). Аспирацию костного мозга выполняли при помощи стандартного шприца объемом 20 мл, содержащего 4 мл предварительно разведенного в физиологическом растворе антикоагулянта (200 мл физиологического раствора + 5 мл 25 000 Ед гепарина). Аспират собирали в стерильный трансфузиологический пакет-контейнер. Для пункции и аспирации костного мозга использовали в среднем 4-5 точек в проекции заднего гребня подвздошной кости с каждой стороны. Полученный материал сразу же транспортировали в изотермическом боксе в лабораторию Покровского банка стволовых клеток. Изоляция мононукеарных клеток аутологичного костного мозга Через 2 часа после процедуры забора костного мозга в лаборатории Покровского банка стволовых клеток осуществляли процесс изоляции МНК аутологичного костного мозга. Для получения МНК применяли автоматизированный сепаратор костного мозга и компонентов крови MacoPress Smart (MacoPharma, Франция). После получения МНК оценивали жизнеспособность полученных клеток, затем проводили фенотипирование при помощи проточной цитометрии (Beckman Coulter, США) маркерами CD45+ и CD34+. После детального исследования суспензию клеток помещали в буферный раствор, состоящий из физиологического раствора, раствора 20 % человеческого альбумина (2500 Ед), раствора гепарина, и транспортировали в изотермическом боксе в клинику. Введение мононуклеарных клеток аутологичного костного мозга В условиях рентген-операционной под местной анестезией выполняли транскутанную пункцию правой (n = 6) и левой (n = 2) ветвей воротной вены под ультразвуковой навигацией c использованием пункционной иглы и проводника Cordis Emerald (Milpitas, США). Дилатационный катетер размером 4F (CookMedical, USA) устанавливали в ствол воротной вены. Выполняли прямую портографию по стандартной методике. В процессе портографии оценивали коллатерали портальной вены и выраженность портальной гипертензии. Для определения оптимальной скорости селективной перфузии сегментарных ветвей портальной вены прибегали к портофлоуметрии. После уточнения индивидуальной оптимальной скорости селективной перфузии сегментарных ветвей портальной вены осуществляли инфузию суспензии МНК аутологичного костного мозга при помощи автоматизированного инжектора. Для снижения риска кровотечения пункционный канал пломбировали гемостатической губкой. По завершении операции проводили ультразвуковое исследование брюшной полости для исключения кровотечения и гематомы. Результаты исследования и их обсуждение Методом билатеральной трепан-аспирации из заднего гребня подвздошной кости получено от 224 до 320 мл аспирата аутологичного костного мозга. Объем мононуклеарных клеток составил от 47,1 до 58,3 мл (медиана - 47 мл); абсолютное количество жизнеспособных МНК - 1,24 · 109-5,84 · 109, а CD34+ - 2,54 · 106-48,20 · 106. Подробная характеристика полученных клеток в каждом случае представлена в табл. 2. После катетеризации портальной вены и прямой портографии во всех случаях отмечено наличие венозных внепеченочных коллатералей (мезентериальные, умбиликальные вены, левая желудочная и пищеводные вены). Выполняли портофлоуметрию с различной скоростью введения раствора контрастного вещества. Так, у пациента 8 при портофлоуметрии (0,5; 1; 1,5; 2; 3 мл/с) была идентифицирована оптимальная для него скорость инфузии в портальную вену (ПВ) - 1 мл/с (рис. 2). При скорости введения более чем 1 мл/с определяли сформированные вследствие прогрессирования ЦП и портальной гипертензии коллатерали (рис. 3). Благодаря данной методики была достигнута селективная перфузия сегментарных ветвей портальной вены при введении, что позволило избежать потери клеток по коллатералям. В каждом случае определена индивидуальная скорость селективной перфузии сегментарных ветвей портальной вены (см. табл. 2). Во время процедуры получения костного мозга и процедуры введения МНК серьезных нежелательных явлений зафиксировано не было. В каждом случае пациенты отмечали умеренную болезненность при трепан-аспирации костного мозга и катетеризации портальной вены. В первые 3 мес. наблюдения после внутрипортального введения МНК осложнений не наблюдалось. У всех пациентов в период 3 мес. после введения МНК наблюдалась стабилизация ЦП - отсутствие ухудшения исходного статуса по данным MELD и Child-Turcotte-Pugh (табл. 3). Отмечено улучшение физического здоровья по опроснику SF-36. При динамическом наблюдении у большинства пациентов зарегистрированы стабилизация или улучшения основных биохимических показателей функции печени после терапии МНК (табл. 4). Пациент 1 в последующем был исключен из исследования из-за нарастающей печеночной недостаточности на фоне рецидивирующего кровотечения из варикозных вен пищевода на 2-м месяце наблюдения. При гистологическом и иммуногистохимическом исследовании биоптатов печени до и через 3 мес. после введения МНК наблюдалось снижение лейкоцитарной инфильтрации, жировой дистрофии печени и умеренное повышение маркера Ki67 (рис. 4). В 1 случае отмечено повышение маркера внутриклеточного АФП через 3 мес. после введения МНК. Безусловно, единственным радикальным способом лечения ЦП является ТП, однако при дефиците донорских органов трансплантологическая помощь имеет ограниченную доступность, в том числе и в РФ. Так, показатель донорства печени в Российской Федерации составляет 2,1 на 1 млн населения, что в 7-8 раз ниже, чем в европейских странах. По данным VII сообщения регистра Российского трансплантологического общества по итогам 2016 г., в листе ожидания на ТП находилось 899 пациентов. Смертность в листе ожидания за 2016 г. составила 85 человек [2]. Наиболее вероятным способом снижения смертности от печеночной недостаточности в листе ожидания на ТП можно рассматривать методику аутотрансплантации или инфузии МНК аутологичного костного мозга реципиента, что может послужить хорошим «мостом» к ТП в условиях ее ограниченной доступности. Одним из механизмов улучшения функции может стать способность выделения эндотелиального фактора роста стволовыми клетками, улучшающая кровоснабжение клеток и способствующая репарации поврежденной ткани [12]. Одним из пионеров в аутотрансплантации костного мозга человека для улучшения функции печени являются S. Terai et al., которые показали эффективность аутотрансплантации мононуклеарной фракции костного мозга человека при системном внутривенном введении клеток. У 9 пациентов с ЦП различной этиологии на 4-й и 24-й неделе после введения клеток отмечалось статистически значимое улучшение значений Child-Turcotte-Pugh (p < 0,05), повышение уровня альбумина и общего белка в крови (p < 0,05), увеличение пролиферативной активности (AFP, PCNA) гепатоцитов в биоптате (p < 0,05), снижение уровня асцита по данным компьютерной томографии в постинфузионном периоде [12]. Были проведены серии клинических испытаний, в которых исследователи использовали инфузию аутологичных стволовых клеток костного мозга в печень. Ранее J.S. Esch et al. предложили внутрипортальное введение CD133+ клеток костного мозга в печень для регенерации и увеличения объема печени перед предстоящей расширенной гемигепатэктомией. Авторы получили увеличение в 2,5-кратном размере левого латерального сегмента в исследуемой группе при портальной эмболизации в сочетании с внутрипортальной инфузией CD133+ аутологичных клеток костного мозга по сравнению с группой, где стандартно применяли только внутрипортальную эмболизацию (абсолютная прибавка к левому латеральному сегменту составила 111-235 мл против 93-102 мл) [6]. В свою очередь, N. Leviсar et al. использовали внутрипортальную и артериальную методику инфузии изолированной популяции CD34+-клеток аутологичного костного мозга, полученных при помощи мобилизации костного мозга пациентов с использованием G-CSF и последующим получением клеток из периферической крови. Авторами отмечено снижение уровня билирубина и повышение альбумина в крови исследуемой группы, а у 2 пациентов разрешение асцита в течение 12 мес. наблюдения. Серьезных осложнений в процессе исследования и корреляции терапевтического эффекта с концентрацией введенных клеток 1 · 106-2 · 108 выявлено не было [10]. P. Andreoni et al. сообщили о положительном эффекте с улучшением показателя Child-Turcotte-Pugh (p = 0,045) при внутриартериальном введении (собственная печеночная артерия) CD133+-клеток костного мозга в результате их мобилизации из периферической крови [3]. L. Peng et al. в своей работе отмечают безопасность внутриартериального введения аутологичных стволовых клеток костного мозга при длительном наблюдении (192 недель) у пациентов с печеночной недостаточностью в исходе вирусного гепатита B. Улучшение показателей билирубина, АЛТ, АСТ, альбумина и протромбина наблюдалось в течение 36 недель, однако статистически достоверных данных получить не удалось. Исследователи предположили улучшение результатов при многократном системном или внутрипортальном введении клеток [8]. G. Vassilopoulos et al. показали восстановление печеночной ткани мезенхимными клетками костного мозга человека на животной модели путем слияния в условиях in vivo. Авторы описали умеренное количество полиплоидных гепатоцитов в узелковом регенерате, экспрессирующих как собственные, так и донорские гены [4]. R.A. Malcolm et al. в клиническом исследовании продемонстрировали, что экстрапеченочные стволовые клетки экзогенного и эндогенного происхождения могут колонизировать печень и экспрессировать цитокератин 8, специфический маркер гепатоцитов [9]. Обнаруженная экспрессия маркера гепатоцитов позволила предположить их функциональную секреторную способность. K.D. Lee et al. показали, что мезенхимные клетки, полученные из костного мозга и пуповинной крови человека в условиях in vitro, способны к дифференцировке в сторону гепатоцитподобных клеток, а также к синтезу альбумина, депонированию гликогена, секретированию мочевины, захвату липопротеинов низкой плотности и активированию цитохрома P450 индуцированного фенобарбиталом [7]. Y. Sato et al. установили способность трансдифференцировки мезенхимных клеток человека in vivo. Гепатоцитподобные клетки экспрессировали специфичный для человека альфа-протеин (AFP), альбумин (Alb), цитокератин 19 (CK19), цитокератин 18 (CK18) и рецептор сиалогликопротеина (AGPR) [13]. Ранее H.C. Fiegel et al. доказали, что гемопоэтические стволовые клетки (CD34+) костного мозга в условиях in vitro в присутствии фактора роста гепатоцитов (HGF) начинают экспрессировать CK19, при этом обнаруживается РНК альбумина и сохраняется пролиферативная активность (Ki67) после 28 дней культивирования [5]. Исходя из этих данных, следует признать способность мезенхимных и гемопоэтических стволовых клеток влиять на регенеративные способности печеночной ткани. В нашем исследовании мы подтвердили безопасность получения большого объема костного мозга методом билатеральной трепан-аспирации. Автоматизированная сепарация костного мозга обеспечивает высокую жизнеспособность МНК и CD34+-клеток в отличие от методики фикол-градиентного центрифугирования. Несмотря на полученные CD34+-клетки с высокой жизнеспособностью (свыше 98 %), их абсолютное значение составляет менее 5 · 107 клеток. Вероятно, культивирование клеток позволило бы увеличить количество вводимых CD34+-клеток. Необходимо отметить, что в полученных МНК помимо гемопоэтических стволовых клеток (CD34+) содержатся также мезенхимные стволовые клетки. Их фенотипирование могло бы стать информативным для комплексной оценки вводимых МНК. Катетеризация портальной вены несет определенный риск кровотечения в условиях асцита и умеренной коагулопатии у пациентов с ЦП. Однако предварительная эвакуация асцита, применение методики пломбировки пункционного канала гемостатической губкой позволяют минимизировать геморрагические осложнения. Изучив особенности внутрипортального введения МНК аутологичного костного мозга, мы подтвердили наличие портальной гипертензии с формированием венозных коллатералей и изменение портальной гемодинамики. В связи с этим возник вопрос инфузии и селективной доставки в печень МНК в этих условиях. Для решения этой проблемы экспериментальным путем после проведения прямой портографии с помощью предварительной портофлуометрии мы устанавливали оптимальную скорость селективной перфузии сегментарных ветвей воротной вены для каждого пациента, что позволило избежать потери клеток по внепеченочным венозным коллатералям (см. табл. 2, рис. 2, 3). Необходимо отметить, что при внутрипортальном и внутриартериальном введении гемопоэтических и мезенхимных стволовых клеток аутологичного костного мозга в ранее проведенных исследованиях авторы не рассматривали актуальность скорости введения клеток. Таким образом, нами апробирована персонализированная методика введения предварительно подготовленного аутологичного клеточного материала в воротную вену реципиента с учетом особенностей портальной гемодинамики и оптимальной скорости селективной перфузии сегментарных ветвей воротной вены. Заключение В исследовании доказана безопасность внутрипортальной терапии МНК у пациентов в листе ожидания ТП. Продемонстрирована методика таргетной доставки МНК аутологичного костного мозга в печень, позволяющая минимизировать их потерю при внутрипортальном способе введения. Для оценки эффективности воздействия мононуклеарных клеток аутологичного костного мозга требуется увеличение выборки пациентов, сроков наблюдения и дальнейшее усовершенствование данной методики. Благодарность Авторы выражают благодарность за получение МНК аутологичного костного мозга и проведение внутрипортальной терапии ООО «Покровский банк стволовых клеток» (Санкт-Петербург) и группе специалистов рентгенэндоваскулярной методики диагностики и лечения ФГБУ «РНЦРХТ им. акад. А.М. Гранова» МЗ РФ - А.С. Полехину, А.В. Моисеенко, врачу-хирургу группы трансплантации, канд. мед. наук И.И. Тилеубергенову. Также авторы выражают благодарность заведующему лаборатории иммуногистохимии центра д-ру мед. наук Г.А. Раскину.

About the authors

D A Granov

A.M. Granov Russian Research Center of Radiology and Surgical Technologies

A R Sheraliev

A.M. Granov Russian Research Center of Radiology and Surgical Technologies

O A Gerasimova

A.M. Granov Russian Research Center of Radiology and Surgical Technologies

A A Polikarpov

A.M. Granov Russian Research Center of Radiology and Surgical Technologies

References

  1. Шевела Е.Я., Старостина Н.М., Пальцев А.И., и др. Эффективность клеточной терапии при циррозе печени // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2015. - № 4. - С. 232-138. [Shevela EY, Starostina NM, Pal’tsev AI, et al. Effektivnost’ kletochnoy terapii pri tsirroze pecheni. Kletochnye tekhnologii v biologii i meditsine. 2015;(4):232-138. (In Russ.)]
  2. Готье С.В., Хомяков С.М. Донорство и трансплантация органов в Российской Федерации в 2016 году // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2017. - Т. 19. - № 2. - С. 6-26. [Gautier SV, Khomyakov SM. Donorstvo i transplantatsiya organov v Rossiyskoy Federatsii v 2016 godu. Vestnik transplantologii i iskusstvennykh organov. 2017;19(2):6-26. (In Russ.)]
  3. Andreone P, Catani L, Margini C, et al. Reinfusion of highly purified CD133+ bone marrow-derived stem/progenitor cells in patients with end-stage liver disease: A phase I clinical trial. Dig Liver Dis. 2015;47(12):1059-1066. doi: 10.1016/j.dld.2015.08.018.
  4. Vassilopoulos G, Wang PR, Russell DW. Transplanted bone marrow regenerates liver by cell fusion. Nature. 2003;422(6934):901-904. doi: 10.1038/nature01539.
  5. Fiegel HC, Lioznov MV, Cortes-Dericks L, et al. Liver-specific gene expression in cultured human hematopoietic stem cells. Stem Cells. 2003;21(1):98-104. doi: 10.1634/stemcells.21-1-98.
  6. am Esch JS, 2nd, Knoefel WT, Klein M, et al. Portal application of autologous CD133+ bone marrow cells to the liver: a novel concept to support hepatic regeneration. Stem Cells. 2005;23(4):463-470. doi: 10.1634/stemcells.2004-0283.
  7. Lee KD, Kuo TK, Whang-Peng J, et al. In vitro hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells. Hepatology. 2004;40(6):1275-1284. doi: 10.1002/hep.20469.
  8. Peng L, Xie DY, Lin BL, et al. Autologous bone marrow mesenchymal stem cell transplantation in liver failure patients caused by hepatitis B: short-term and long-term outcomes. Hepatology. 2011;54(3):820-828. doi: 10.1002/hep.24434.
  9. Alison MR, Poulsom R, Jeffery R, et al. Hepatocytes from non-hepatic adult stem cells. Nature. 2000;406(6793):257. doi: 10.1038/35018642.
  10. Levicar N, Pai M, Habib NA, et al. Long-term clinical results of autologous infusion of mobilized adult bone marrow derived CD34+ cells in patients with chronic liver disease. Cell Prolif. 2008;41 Suppl 1:115-125. doi: 10.1111/j.1365-2184.2008.00491.x.
  11. Rehman J, Traktuev D, Li J, et al. Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells. Circulation. 2004;109(10):1292-1298. doi: 10.1161/01.CIR.0000121425.42966.F1.
  12. Terai S, Ishikawa T, Omori K, et al. Improved liver function in patients with liver cirrhosis after autologous bone marrow cell infusion therapy. Stem Cells. 2006;24(10):2292-2298. doi: 10.1634/stemcells.2005-0542.
  13. Sato Y, Araki H, Kato J, et al. Human mesenchymal stem cells xenografted directly to rat liver are differentiated into human hepatocytes without fusion. Blood. 2005;106(2):756-763. doi: 10.1182/blood-2005-02-0572.

Statistics

Views

Abstract - 124

PDF (Russian) - 22

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2018 Granov D.A., Sheraliev A.R., Gerasimova O.A., Polikarpov A.A.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies