Рathomorphological features of corneal regeneration in experimentally induced dystrophy against the background of intrastromal administration of autologous mononuclear leukocytes

Abstract


The purpose of research is study the features of the flow of reparative regeneration of the cornea in an experiment in vivo with induced bullous keratopathy after the introduction of a suspension of autologous mononuclear leukocytes in the posterior third of the corneal stroma. Materials and methods. The experiment was performed on 27 chinchilla rabbits (27 eyes). At the first stage of the experiment all animals were reproduced the model of corneal bullous keratopathy by mechanical damage and removal of its endothelial layer. At the second stage, 2 weeks after the development of the disease, the animals were divided, depending on the planned treatment, into 2 groups: the main, 12 animals once in the back third of the corneal stroma were administered a suspension of autologous mononuclear leukocytes; comparisons, 12 animals were treated by conservative therapy. Results. Reproduction of in vivo bullous keratopathy of the cornea by mechanical damage and removal of its endothelial layer is accompanied by rapid (within 2 weeks) the development of the disease with diffuse hydropic degeneration of the anterior epithelium, marked edema of the stroma with the bundle of collagen fibers. On the experimental model of the bullous keratopathy of cornea it was found that the introduction of a suspension of autologous mononuclear leukocytes in the posterior third of the corneal stroma in the treatment of the disease provides rapid (1.5 times) dehydration of the stroma, reduces the number of dystrophic cells in the anterior epithelium by 1.2 times compared with conservative treatment. The period of restoration of the normal thickness of the corneal slice in animals of the main group is reduced by 1.4 times. The conclusion. The introduction of autologous mononuclear leukocytes suspension into the posterior third of the corneal stroma in the treatment of experimental bullous keratopathy of cornea induces reparative regeneration, accelerating the restoration of damaged corneal structures and preventing its neovascularization.

Введение Эндотелиально-эпителиальная дистрофия (ЭЭД) роговицы - заболевание, развивающееся вследствие повреждающего действия различных патологических факторов на эндотелий роговой оболочки [1]. Согласно литературным данным [2, 3], от 0,6 до 11 % всех оперативных вмешательств по поводу возрастной катаракты осложняется развитием ЭЭД роговицы в послеоперационном периоде. При удалении травматических катаракт частота осложнения возрастает до 35-69 %. Одной из важнейших функций эндотелия является защита роговицы от избыточного пропитывания внутриглазной жидкостью. При ЭЭД дисфункция данного слоя приводит к увеличению просачивания водянистой влаги в строму роговицы, обусловливая прогрессирующее развитие отека основного вещества с последующим распространением на эпителий роговой оболочки и формированием булл - резко увеличенных вследствие скопления жидкости эпителиоцитов. Заболевание характеризуется хроническим, неуклонно прогрессирующим течением, трудно поддается лечению и завершается формированием грубого помутнения роговицы со значительным, вплоть до светоощущения, снижением зрительных функций. В последнее десятилетие в мировой практике отмечается рост экспериментальных и клинических исследований, связанных с применением клеточной терапии в лечении заболеваний различных органов и систем (центральная нервная система, миокард и т. д.) [4, 5]. Использование аутологичных клеток крови исключает развитие иммунологической несовместимости и гемотрансмиссивных инфекций. В офтальмологии с целью коррекции воспалительно-регенеративных процессов в тканях глазного яблока при различной патологии органа зрения активно используются цитокины, представляющие собой единую самостоятельную систему регуляции функций организма. Данная система обеспечивает развитие защитных реакций и поддержание гомеостаза при внедрении патогенов и нарушении целостности тканей. В настоящее время в России зарегистрированы препараты цитокинов, содержащие интерферон α-2b, для местного применения при лечении различных заболеваний органа зрения. Вместе с тем действие именно комбинации естественных аутологичных цитокинов максимально приближено к физиологическому и создает оптимальные условия для функционирования иммунной системы [6]. Локальное применение аутоцитокинов оказывает выраженное противовоспалительное и регенераторное действие при лечении проникающих ранений глаз, ожогов роговицы, увеитов [6-8]. Имеются сообщения об успешном применении цитокинов в лечении послеоперационной ЭЭД роговицы [9]. Основным источником данных биологически активных веществ являются мононуклеарные лейкоциты крови, обладающие высоким секреторным потенциалом. Необходимо отметить, что одним из ключевых моментов применения клеточной терапии при лечении ЭЭД роговицы является разработка максимально эффективного способа доставки комплекса аутоцитокинов к патологически измененному эндотелию роговой оболочки. Цель исследования - в эксперименте in vivo изучить особенности течения репаративной регенерации роговицы при индуцированной ЭЭД после введения суспензии аутологичных мононуклеарных лейкоцитов в заднюю треть стромы роговой оболочки. Материалы и методы исследования Исследование выполнено на базе лаборатории биологических моделей (руководитель - канд. биол. наук В.В. Иванов) ФГБОУ ВО СибГМУ. Протокол проведения экспериментальных исследований утвержден локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО СибГМУ Минздрава России от 30.10.2017, регистрационный номер 5597. Эксперимент проведен на 27 половозрелых кроликах породы Шиншилла массой 2,5-3,0 кг. На первом этапе эксперимента для анализа проявлений ЭЭД роговицы всем животным моделировали заболевание путем механического повреждения и удаления эндотелиального слоя роговой оболочки. На втором этапе эксперимента изучали особенности течения индуцированной ЭЭД роговицы после введения суспензии аутологичных мононуклеарных лейкоцитов в строму роговой оболочки и оценивали особенности течения заболевания в сравнении с фармакотерапией. Для воспроизведения модели ЭЭД роговицы всем животным в условиях операционной под наркозом, достигаемым внутримышечным введением раствора калипсола (6-8 мг/кг массы тела животного) и раствора сибазона (0,2 мг/кг массы тела животного), проводили механическое повреждение и удаление эндотелия роговой оболочки одного из глаз. На втором этапе эксперимента через 2 нед. после развития болезни животных в зависимости от планируемого лечения разделили на две группы. Животным основной группы (12 кроликов, 24 глаза) выполняли хирургическое лечение в виде однократного введения в заднюю треть стромы роговицы суспензии аутологичных мононуклеарных лейкоцитов крови. Клетки выделяли непосредственно перед операцией методом фракционирования на градиенте плотности. Чистота мононуклеаров, полученных на градиенте фиколл - верографин, составляла 96-98 %. Жизнеспособность клеточного материала оценивали в тесте с трипановым синим. Окрашенные (погибшие) элементы составляли 1,5-2,0 %, что не превышало допустимое (не более 3 %) количество. В операционной под наркозом животным основной группы прелимбально сверху на уровне задней трети собственного вещества роговой оболочки вводили иглу калибра 25 G и аккуратно продвигали ее в парацентральные отделы. Путем введения стерильного воздуха в объеме 0,3-0,5 мл в центральные отделы роговицы индуцировали отслойку десцеметовой оболочки, после чего в зону отслойки вводили клеточную суспензию в объеме 0,3-0,5 мл. В послеоперационном периоде для профилактики присоединения вторичной инфекции в оперированный глаз инстиллировали раствор антибиотика (тобрамицин) 4 раза в день. Животные группы сравнения (12 кроликов, 24 глаза) получали консервативное лечение индуцированной ЭЭД роговицы в виде инстилляций метаболических средств (0,01 % водный раствор витамина В2), кератопротекторов (5 % глазной гель дексапантенол) 4 раза в день. Общая продолжительность эксперимента составила 35 суток. Животных выводили из эксперимента на 3, 7, 14 и 21-е сутки (по 3 животных из каждой группы). Полученный материал фиксировали в 10 % растворе нейтрального формалина, заливали в парафин для световой микроскопии. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, по методу Ван-Гизона. Животных из эксперимента выводили с соблюдением правил и норм Европейского сообщества (86/609 EEC) и Хельсинской декларации. Для количественной оценки в 10 случайных полях зрения при 400-кратном увеличении микроскопа высчитывали площадь участков отечной стромы. При 900-кратном увеличении микроскопа в 10 случайных полях зрения подсчитывали количество дистрофических эпителиоцитов переднего эпителия роговицы, число новообразованных сосудов стромы. Толщину среза роговицы глаз экспериментальных животных измеряли с помощью окулярной вставки. Просмотр, подсчет и фотографирование срезов производили на микроскопе ЛОМО Микмед 6 (Россия) и цифровой камере ЛОМО МС5 (Россия). Для обработки полученных данных использовали программу McView. Статистический анализ полученных данных проводили с использованием статистического пакета IBM SPSS Statistics 20. Результаты представлены в виде M ± m, где М - выборочное среднее, m - ошибка среднего. Нормальность распределения показателей проверяли при помощи закона Колмогорова - Смирнова. В связи с несоответствием распределения данных закону распределения применяли непараметрический критерий - t-критерий Уилкоксона. Результаты Через две недели после моделирования в эксперименте in vivo ЭЭД роговицы путем механического повреждения и удаления ее эндотелиального слоя у всех животных в роговой оболочке по данным световой микроскопии обнаруживались патогномоничные для данного заболевания изменения. В клетках переднего эпителия роговицы отмечались диффузные явления гидропической дистрофии: вакуолизация цитоплазмы, гиперхромия ядер. Количество дистрофически измененных эпителиоцитов составляло 22 ± 1,0 клетки в поле зрения. Строма роговицы была представлена гидратированными рыхло расположенными коллагеновыми волокнами. Площадь участков основного вещества, подверженных отеку, достигала 602 ± 14 мкм2. Наблюдались неравномерное утолщение задней пограничной мембраны и отсутствие эндотелия на всем протяжении (рис. 1). Толщина роговой оболочки составляла 576 ± 37 мкм (при норме 350-380 мкм). Необходимо отметить, что сроки появления морфологических признаков экспериментально индуцированной ЭЭД роговицы сопоставимы с таковыми при развитии болезни в клинических условиях. Это, в свою очередь, свидетельствует об адекватности выбранной модели заболевания. После морфологического подтверждения развития ЭЭД роговой оболочки при моделировании in vivo переходили ко второму этапу эксперимента. Согласно данным световой микроскопии у животных основной группы на 3-и сутки после интрастромального введения суспензии аутологичных мононуклеарных лейкоцитов в переднем эпителиальном слое роговицы отмечалось уменьшение количества эпителиоцитов с признаками гидропической дистрофии в 2,0 раза (p < 0,05) от исходного уровня (табл. 1). Строма роговицы содержала рыхло расположенные пучки коллагеновых волокон. Общая площадь отечной стромы составляла 495 ± 12 мкм2, сократившись в 1,2 раза (p < 0,05) от исходного уровня. В центральных отделах роговицы определялась зона отслойки десцеметовой оболочки, занимающая 1/2 ее общей площади. В собственном веществе в данном участке обнаруживалась диффузная мононуклеарная инфильтрация - 96 ± 1,0 клетки в поле зрения. Эндотелий отсутствовал на всем протяжении. Отмечалось уменьшение толщины среза роговицы, однако не являющееся статистически значимым (p > 0,05) (табл. 2). У животных группы сравнения на 3-и сутки от начала консервативного лечения статистически значимых различий в количестве дистрофических эпителиоцитов в слое переднего эпителия роговицы при сравнении с исходными данными не выявлено (p > 0,05) (см. табл. 1). В строме обнаруживался диффузный отек собственного вещества с незначительным уменьшением его площади до 521 ± 25 мкм2 (p > 0,05). Уменьшение толщины среза роговицы также не было статистически значимым (p > 0,05) (см. табл. 2). Эндотелий отсутствовал на всем протяжении. На 7-е сутки у животных основной группы отмечалось значительное (в 2,7 раза, p < 0,05) уменьшение количества дистрофически измененных клеток в слое переднего эпителия роговой оболочки по сравнению с первоначальным значением (см. табл. 1). Ход коллагеновых волокон собственного вещества роговицы на уровне наружных 2/3 стромы становился более упорядоченным (рис. 2). В задней 1/3 стромы пучки коллагена сохраняли извитость. Общая площадь отека стромы уменьшилась в 1,6 раза от исходного уровня (p < 0,05), составив 374 ± 22 мкм2. Зона отслойки десцеметовой оболочки в центральных отделах роговицы уменьшилась до 1/3 от площади оболочки, однако в собственном веществе сохранялась мононуклеарная инфильтрация - 68 ± 2 клетки в поле зрения. Толщина среза роговицы была меньше исходного значения в 1,2 раза (p > 0,05) (см. табл. 2). На внутренней поверхности роговицы обнаруживались клетки отростчатой формы. У животных группы сравнения в переднем эпителии роговицы сохранялись признаки гидропической дистрофии. Тем не менее общее число дистрофических эпителиоцитов уменьшилось в 1,3 раза от исходного (p < 0,05) (см. табл. 1). В строме роговицы наблюдалось уменьшение общей площади отека основного вещества в 1,3 раза от исходного значения - до 486 ± 34 мкм2. Толщина среза роговой оболочки уменьшилась в 1,1 раза от первоначального уровня (p > 0,05) (см. табл. 2). Задний эпителий отсутствовал на всем протяжении (рис. 3). На 14-е сутки у животных основной группы в переднем эпителии роговицы определялись лишь единичные клетки, подверженные гидропической дистрофии (см. табл. 1). Вблизи задней пограничной мембраны обнаруживался незначительный отек коллагеновых волокон. Общая площадь отека основного вещества роговицы уменьшилась в 3,9 раза (p < 0,05) от исходного значения и не превышала 152 ± 23 мкм2. Толщина среза роговицы уменьшилась в 1,3 раза от исходного уровня (p < 0,05) (см. табл. 2). Десцеметова мембрана в зоне индуцированной отслойки полностью восстановила нормальное расположение. Мононуклеарная инфильтрация в задней трети собственного вещества составляла 12,0 ± 1,0 клетки в поле зрения. Эндотелий был представлен слоем отростчатых клеток. У животных группы сравнения в переднем эпителии роговицы число дистрофически измененных клеток уменьшилось в 1,7 раза от исходного значения (p < 0,05) (см. табл. 1). Коллагеновые волокна собственного вещества были неравномерно утолщены и сохраняли рыхлое расположение. Общая площадь отека стромы роговицы уменьшилась в 1,6 раза от первоначального значения (p < 0,05) и составила 372 ± 89 мкм2. Толщина среза роговой оболочки уменьшилась от исходного уровня в 1,2 раза (p < 0,05) (см. табл. 2). При этом в средней трети собственного вещества обнаруживались единичные новообразованные сосуды. Эндотелий состоял из неравномерного, местами слущивающегося слоя дистрофически измененных клеток. На 21-е сутки у животных основной группы после интрастромального введения суспензии аутологичных мононуклеарных лейкоцитов передний эпителий имел нормальное строение и был представлен 4-5 слоями плоских клеток. Боуменова оболочка визуализировалась на всем протяжении. Собственное вещество роговицы состояло из компактно расположенных коллагеновых волокон с нормальными тинкториальными свойствами. Задняя пограничная мембрана дифференцировалась на всем протяжении и была гомогенна. Эндотелий визуализировался в виде сплошного слоя отростчатых клеток (рис. 4). Толщина среза роговой оболочки уменьшилась в 1,5 раза от исходного уровня (p < 0,05) (см. табл. 2), что свидетельствовало о восстановлении ее гистоархитектоники. У животных группы сравнения, получавших консервативное лечение, в переднем эпителии роговицы количество гидропически измененных клеток уменьшилось в 5,5 раза от исходного значения (p < 0,05) (см. табл. 1). Общая площадь отека основного вещества роговой оболочки уменьшилась в 2,0 раза от исходного уровня (p < 0,05), составив 301 ± 45 мкм2. Однако в строме отмечалось увеличение числа новообразованных сосудов - до 6,0 в поле зрения. Эндотелий состоял из слоя дистрофически измененных клеток (рис. 5). Толщина среза роговицы при этом уменьшилась в 1,3 раза от исходного уровня (p < 0,05) (табл. 2). Обсуждение Гистологическое исследование позволило выявить, что введение суспензии аутологичных мононуклеарных лейкоцитов в заднюю треть стромы роговой оболочки при лечении экспериментальной ЭЭД роговицы способствует более быстрой (в 1,5 раза) дегидратации основного вещества с упорядочиванием хода коллагеновых волокон, а также ускоряет в 1,2 раза уменьшение числа дистрофических эпителиоцитов переднего эпителия роговицы по сравнению с курсом консервативного лечения. При этом период восстановления нормальной толщины среза роговой оболочки у животных основной группы по данным световой микроскопии сокращается в 1,4 раза. Как известно, мононуклеарные лекойкоциты крови являются одним из источников цитокинов, участвующих в регуляции воспаления, ангио- и фиброгенеза [2, 7]. Вероятно, аутологичные мононуклеарные лейкоциты, введенные в заднюю треть стромы роговицы при экспериментальной ЭЭД, то есть максимально близко к поврежденному эндотелиальному слою оболочки, создают концентрацию биологически активных веществ, достаточную для уменьшения выраженности отека основного вещества и ослабления эффекта контактного ингибирования. Это, в свою очередь, оказывает индуцирующее влияние на клетки переднего и заднего эпителия с повышением их пролиферативной активности и регенераторной способности. Заключение Воспроизведение ЭЭД роговицы в эксперименте in vivo путем механического повреждения и удаления эндотелиального слоя данной оболочки сопровождается развитием характерных для заболевания патоморфологических изменений всех слоев роговой оболочки. Введение суспензии аутологичных мононуклеарных лейкоцитов в заднюю треть стромы роговицы при лечении экспериментальной ЭЭД роговой оболочки индуцирует репаративную регенерацию, ускоряя восстановление поврежденных структур роговицы и препятствуя ее неоваскуляризации. Полученные данные представляют интерес и заслуживают дальнейшего изучения. Исследование выполнено при поддержке гранта Фонда содействия инновациям УМНИК-2017.

M S Denisko

Siberian State Medical University

O I Krivosheina

Siberian State Medical University

E O Filippova

Siberian State Medical University

L R Mustafina

Siberian State Medical University

  1. Бикбов М.М., Шевчук Н.Е., Мальханов В.Б. Цитокины в клинической офтальмологии. - Уфа: Уфимский полиграфкомбинат, 2008. [Bikbov MM, Shevchuk NE, Mal’khanov VB. Tsitokiny v klinicheskoy oftal’mologii. Ufa: Ufimskiy poligrafkombinat; 2008. (In Russ.)]
  2. Запускалов И.В., Кривошеина О.И. Современная фармакотерапия язвенных поражений роговицы: применение аутологичных мононуклеаров крови. - Саабрюкен: Lambert Academic Publishing, 2013. [Zapuskalov IV, Krivosheina OI. Sovremennaya farmakoterapiya yazvennykh porazheniy rogovitsy: primenenie autologichnykh mononuklearov krovi. Saarbrücken: Lambert Academic Publishing; 2013. (In Russ.)]
  3. Каспарова Е.А., Суббот А.М., Антохин А.И., Павлюк А.С. Клиническая эффективность персонализированной клеточной терапии заболеваний эндотелия роговицы // Катарактальная и рефракционная хирургия. - 2011. - Т. 11. - № 2. - С. 45-49. [Kasparova EA, Subbot AM, Antokhin AI, Pavlyuk AS. Clinical efficacy of personalized cell therapy for endothelial keratitis. Kataraktal’naya i refraktsionnaya khirurgiya. 2011;11(2):45-49. (In Russ.)]
  4. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. - СПб.: Фолиант, 2008. [Ketlinskiy SA, Simbirtsev AS. Tsitokiny. Saint Petersburg: Foliant; 2008. (In Russ.)]
  5. Никитин Н.А., Кузбеков Ш.Р. Роль TGFβ в офтальмологии // Цитокины и воспаление. - 2009. - Т. 8. - № 1. - С. 3-9. [Nikitin NA, Kuzbekov SR. The role of TGFβ in ophthalmology. Cytokines & inflammation. 2009;8(1):3-9. (In Russ.)]
  6. Каспарова Е.А., Суббот А.М. Пролиферативный потенциал заднего эпителия роговицы человека // Вестник офтальмологии. - 2013. - Т. 129. - № 3. - С. 82-88. [Kasparova EA, Subbot AM. Proliferative potential of human corneal endothelium. Annals of ophtalmology. 2013;129(3):82-88. (In Russ.)]
  7. Слепова О.С. Патогенетическая роль цитокинов при различных заболеваниях глаз как основа для прогнозирования и выбора тактики иммунокорригирующего лечения // Российский офтальмологический журнал. - 2008. - Т. 1. - № 3. - С. 36-42. [Slepova OS. The pathogenetic role of cytokines in various eye diseases as a basis for prognostication and the choice of immune correction tactics. Rossiiskii oftal’mologicheskii zhurnal. 2008;1(3):36-42. (In Russ.)]
  8. Jeon HS, Yi K, Chung TY, et al. Chemically injured keratocytes induce cytokine release by human peripheral mononuclear cells. Cytokine. 2012;59(2):280-285. doi: 10.1016/j.cyto.2012.04.006.

Views

Abstract - 107

PDF (Russian) - 1

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2018 Denisko M.S., Krivosheina O.I., Filippova E.O., Mustafina L.R.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies