Evaluation of the radioprotective properties of recombinant flagellin when used alone or in combination with interleukin-1 beta

Abstract


Research objective. To evaluate the radioprotective effectiveness of recombinant flagellin when used alone or in combination with interleukin-1 beta for prophylactic or therapeutic effect on animals. Materials and methods. The effect of hybrid flagellin FliC Salmonella typhimurium and human interleukin-1β (Institute of Highly Pure Biopreparations, Saint Petersburg, Russia) on the 30-day survival of male mice exposed to lethal doses of X-ray radiation was studied. Survival of irradiated animals was analyzed by Kaplan-Meier method. Results. The preventive use of flagellin had a protective effect on the 30-day survival of mice irradiated with lethal doses of X-rays. Compared with the irradiated control, the administration of flagellin (1 mg/kg or 2 mg/kg) prior to X-ray exposure (7.5 Gy, 8.0 Gy or 8.5 Gy) increased the animal survival rate to 67-87%. Complex preventive administration of flagellin (1 mg/kg) and interleukin-1 beta (50 μg/kg) provided a 100% survival rate of the irradiated mice. Separate use of drugs was also effective; 92.8% of mice survived when flagellin was administered prior to irradiation and interleukin after. Conclusion. Recombinant flagellin is a promising candidate product for designing new generation of domestic radiation countermeasures, including combinations with interleukin-1 beta.

Введение Стремительное развитие ядерных технологий неизбежно приводит к возрастанию риска радиационных инцидентов разного масштаба, которые могут привести к массовому облучению людей. Широкое использование источников ионизирующих излучений в медицине, в частности в противоопухолевой радиотерапии, также диктует необходимость в создании препаратов, обладающих высокими радиозащитными свойствами в сочетании с низкой токсичностью и хорошей переносимостью, для защиты нормальных тканей от радиационного повреждения и снижения тяжести побочных эффектов. Уже более полувека в ведущих странах мира интенсивно ведутся исследования по разработке радиопротекторов и радиомитигаторов [1-3]. Тем не менее большинство современных перспективных радиозащитных средств эффективны лишь в максимально переносимых дозах, что существенно ограничивает возможность их применения. В качестве потенциальных противолучевых препаратов все шире изучаются физиологически активные соединения природного происхождения, в частности, лиганды рецепторов иммунных клеток, в качестве которых могут выступать консервативные молекулярные структуры бактериальных клеток, вирусов или грибов. Распознавание последних приводит к мощной активации врожденного иммунитета с последующим развитием адаптивного иммунного ответа, что может быть использовано для повышения радиорезистентности организма и/или эффективности терапии радиационных поражений. Успехи современной биотехнологии позволяют синтезировать аналоги данных соединений, в том числе их производные, с сохранением фармакологической активности, при этом важные преимущества биотехнологических молекул заключаются в их стабильности, возможности достаточно быстрой наработки и создания удобной для применения лекарственной формы, а также относительно невысокой стоимости производства. В последние годы расширяются области медицинского применения биотехнологических препаратов, в том числе в радиационной медицине и фармакологии. Целью работы стала экспериментальная оценка противолучевой эффективности рекомбинантного флагеллина при его раздельном применении или в комбинации с интерлейкином-1 бета в условиях профилактического и терапевтического введения животным. Материалы и методы исследования В работе использованы генно-инженерные препараты, синтезированные в Государственном научно-исследовательском институте особо чистых препаратов ФМБА России (ГосНИИ ОЧБ): флагеллин FliC Salmonella typhimurium (ФЛ), синтезированный с использованием плазмидного вектора pET151 и рекомбинантного штамма Escherichia coli в качестве продуцента [4], и интерлейкин-1 бета человека (ИЛ-1b), выпускаемый под коммерческим названием «Беталейкин» и зарегистрированный в качестве стимулятора лейкопоэза при химио- и радиотерапии злокачественных опухолей [5]. Эксперименты выполнены на 550 половозрелых белых беспородных мышах-самцах массой 20-23 г, полученных из питомника лабораторных животных «Рапполово» (Ленинградская область). Животных контрольных и опытных групп содержали в сходных условиях, без ограничения доступа к воде; кормление осуществляли 1 раз в сутки в первой половине дня. Манипуляции с животными проводили с соблюдением Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных. Радиозащитную эффективность препаратов изучали путем оценки выживаемости и динамики гибели мышей, подвергнутых общему относительно равномерному рентгеновскому облучению, за 30-суточный период наблюдения, а также продолжительности жизни павших от облучения животных. Облучение мышей проводили на рентгенотерапевтической установке РУМ-17 при напряжении 180 кВ, силе тока 14 мА, фильтре 0,5 мм Сu + 1 мм Al; направление облучения - спина - грудь; кожно-фокусное расстояние - 50 см; мощность дозы - 0,2 мА/кг (38,4 Р/мин). Для дозиметрического контроля использовали индивидуальный дозиметр ИД-11. Животных разных групп облучали одновременно в утренние часы, для чего по 12-15 особей помещали в пластиковые пеналы, которые фиксировали на вращающейся со скоростью 2 об/мин подставке (кимографе). Выживаемость облученных животных анализировали по методу Каплана - Мейера. Выживаемость мышей подопытных и контрольных групп сравнивали с помощью точного критерия Фишера (двусторонний тест), продолжительность жизни погибших от облучения животных - при помощи критерия Гехана - Уилкоксона. Полученные данные подвергали статистической обработке с помощью пакета прикладных программ Statistica 8,0. Результаты представлены в виде М ± s, где М - среднее значение изучаемого признака, s - среднеквадратическое отклонение, или Ме (Н25; Н75), где Ме - медиана, Н25 и Н75 - нижний и верхний квартили. Различия считали статистически значимыми при р < 0,05 [6]. Результаты и их обсуждение Для установления оптимальных сроков введения ФЛ по отношению к радиационному воздействию были изучены как профилактические, так и терапевтические схемы введения препарата: ±15-30 мин, ±2 ч, ±24 ч. Динамика гибели облученных животных за 30-суточный период наблюдения представлена на рис. 1. Было установлено, что при облучении мышей в дозе 7,5 Гр ФЛ, введенный в дозе 1 мг/кг, проявлял наибольшую радиозащитную эффективность в условиях профилактического применения за 15-30 мин до облучения. Выживаемость животных возросла на 31 % по сравнению с контрольной группой (рис. 1, а). Также защитное действие препарат оказывал при введении его за 2 ч до или через 24 ч после воздействия ионизирующего излучения (рис. 1, б). При введении ФЛ в данных условиях 30-суточная выживаемость увеличилась на 11 % по сравнению с контрольной группой. Было изучено влияние профилактического применения ФЛ (за 15-30 мин до облучения животных) на параметры 30-суточной выживаемости мышей: 1) при введении ФЛ в дозе 1 мг/кг и облучении животных в дозах 6,5; 7,5 и 8,5 Гр (рис. 2, а); 2) при введении в дозах 0,5; 1 и 2 мг/кг до облучения в дозе 8,0 Гр (рис. 2, б). Из представленных данных (см. рис. 2, а) видно, что профилактическое введение рекомбинантного ФЛ оказывало протекторное действие на выживаемость мышей всех опытных групп за 30-суточный период наблюдения, при этом наиболее отчетливо эффект проявлялся при воздействии высоких доз рентгеновского излучения. Выживаемость мышей, облученных в дозах 7,5 и 8,5 Гр с применением ФЛ, составила соответственно 76,9 ± 11,7 и 70,2 ± 10,3 %, что было статистически значимым в сравнении с контрольными группами, летальность в которых составила 70 % (р < 0,05) и 100 % (р < 0,01). При этом радиозащитное действие препарата носило дозозависимый характер (см. рис. 2, б), что, вероятно, объясняет ранее полученные данные об умеренной радиозащитной эффективности отечественного рекомбинантного ФЛ и его делетированного производного, примененных в дозе 0,2 мг/кг [4]. При облучении мышей в дозе 8,0 Гр профилактическое применение ФЛ в дозе 0,5 мг/кг повышало долю выживших животных в сравнении с контрольной группой на 20 %, в дозе 1 мг/кг - на 37 %, в дозе 2 мг/кг - на 67 %. Вместе с тем ни при воздействии разных доз ионизирующего излучения, ни при введении разных доз ФЛ не было выявлено значимого влияния предварительного введения ФЛ на продолжительность жизни погибших от облучения мышей. Более детально результаты данного раздела представлены в ранее опубликованной работе [7]. С целью изучения возможности модификации обнаруженного радиозащитного эффекта рекомбинантного ФЛ было проведено исследование параметров 30-суточной выживаемости облученных летальными дозами рентгеновского излучения мышей при внутрибрюшинном введении ФЛ (1 мг/кг) в сочетании с рекомбинантным ИЛ-1β (50 мкг/кг). Оценивали следующие варианты комплексного применения генно-инженерных препаратов: 1) ФЛ за 15-30 мин до облучения, ИЛ-1β через 15-30 мин после; 2) одновременное применение ФЛ и ИЛ-1β в смеси за 15-30 мин до облучения; 3) одновременное применение препаратов через 15-30 мин после облучения (табл.). Было установлено, что комплексное использование исследуемых препаратов оказывало радиозащитное действие во всех изученных схемах, наибольшая эффективность была отмечена при одновременном введении ФЛ и ИЛ-1β в профилактических целях, которое обеспечивало 100 % выживаемость облученных животных. В случае введения ФЛ за 15-30 мин до облучения животных, а ИЛ-1β сразу после радиационного воздействия выжило 92,8 % мышей. Одновременное применение препаратов сразу после рентгеновского воздействия хотя и повышало выживаемость до 80 % (на 27,7 % по сравнению с контролем), но менее эффективно, чем в других схемах, что подтверждает ранее полученные данные о нецелесообразности использования ФЛ в ранние сроки после острого лучевого воздействия [7]. Таким образом, совместное применение ФЛ с цитокином ИЛ-1β, одним из ключевых медиаторов защитных реакций организма, играющим важную роль в регуляции гемопоэза и иммунной системы [8], позволило усилить радиозащитный эффект. Противолучевые свойства рекомбинантного цитокина ИЛ-1β достаточно хорошо изучены в экспериментах на разных видах лабораторных животных многими исследователями и обобщены в монографии [5]. Однако широкое применение препаратов ИЛ-1β ограничивается существующим риском чрезмерной активации иммунной системы. Возможно, применение комбинаций препаратов, в частности с ФЛ, будет способствовать снижению уровней доз, необходимых для проявления радиозащитного действия, а вместе с тем и рисков возникновения нежелательных эффектов. Способность нативного белка ФЛ, выделенного и очищенного из жгутиков Salmonella typhimurium, оказывать протекторное действие в отношении различных патогенных воздействий - токсикантов, бактерий, вирусов и радиации, была показана M. Vijay-Kumar et al. (2008) [9]. ФЛ разновидности FliC Salmonella dublin был использован для разработки генно-инженерного препарата CBLB502 с коммерческим названием Entolimod (Cleveland BioLabs, США), проявляющего свойства и радиопротектора, и радиомитигатора [10, 11]. Благодаря высокой противолучевой активности в сочетании с низкой токсичностью энтолимод считается перспективным средством противолучевой защиты как в случае поражения людей высокими дозами ионизирующего излучения, так и в качестве средства снижения токсических эффектов радиации при проведении лучевой терапии онкологических больных. По данным V.K. Singh et al. (2017), в настоящее время проходят одобренные FDA США клинические испытания энтолимода [12]. Установлено, что радиозащитный эффект ФЛ обусловлен стимуляцией толл-подобных рецепторов (TLR, от англ. Toll-like receptors) 5-го типа [13], локализованных на поверхности нейтрофилов, макрофагов, дендритных клеток, Т-клеток, разных типов эпителиальных клеток, хотя известно, что TLR5-зависимый сигнальный путь не единственный в проявлении биологической активности белка [14]. Стимуляция флагеллином рецепторов TLR5 приводит к активации ядерного фактора каппа В (NF-kB), являющегося универсальным фактором транскрипции, регулирующим экспрессию генов иммунного ответа, апоптоза и клеточного цикла [15]. Отмечаемое многими исследователями усиление экспрессии антиапоптотических белков, белков-антиоксидантов, цитокинов и факторов роста после введения производного ФЛ [10, 11, 16, 17] обеспечивает защиту организма от радиационно индуцированных повреждений и способствует ускорению постлучевой репарации [18-20]. В последние годы наряду с ФЛ, лигандом TLR5, изучаются радиозащитные свойства агонистов TLR других типов, модифицирующее влияние которых на внутриклеточные сигнальные пути опосредуется активацией NF-kB [21]. В частности, экспериментально показана эффективность лигандов TLR2/6 (CBLB613), TLR9 (CpG-ODN), TLR3 (Poly (I:C), TLR7/8 (IMQ). По мнению авторов, лучевая терапия в сочетании с агонистами TLR может сенсибилизировать раковые клетки к ионизирующему излучению, оказывая в то же время радиопротекторное действие на нормальную ткань. В этой связи хочется отметить, что ФЛ и его производные, как агонисты TLR5, обладают значительным потенциалом в противоопухолевой иммунотерапии, поскольку способны оказывать противометастатическое действие и стимулировать развитие опухолеспецифической иммунологической памяти. Так, показано, что примененный в качестве монотерапии энтолимод вызывал быструю индукцию хемокинов CXCL9 и CXCL10, которые обеспечивали хоуминг в печень циркулирующих в крови натуральных киллеров (НК), экспрессирующих CXCL3, что в конечном счете проявлялось в подавлении активности метастазов различных опухолей в печень. НК-зависимая активация дендритных клеток сопровождалась стимуляцией CD8+ Т-клеточного ответа [22]. Кроме того, введение энтолимода может уменьшать токсические эффекты лекарственных препаратов, применяемых в химиотерапии опухолей, например, 5-фторурацила, не изменяя при этом их противоопухолевой эффективности [23]. На основании этих данных можно предположить, что в случае разработки нового радиозащитного средства на основе ФЛ положительные эффекты его применения не ограничатся противолучевым действием. Заключение Результаты исследования позволяют рассматривать рекомбинантный ФЛ, полученный в ГосНИИ ОЧБ, в качестве перспективного кандидатного препарата для конструирования отечественных средств фармакологической защиты от ионизирующего излучения нового поколения, которые могут использоваться в случае возникновения массовых радиационных поражений, а также для снижения радиационно индуцированных тканевых реакций при радиотерапии опухолей. Разработка композиции рекомбинантных ФЛ и ИЛ-1β может способствовать усилению радиозащитного эффекта и, возможно, снижению эффективных доз препаратов, что в конечном счете приведет к минимизации риска развития негативных эффектов их применения.

E V Murzina

S.M. Kirov Military Medical Academy

G A Sofronov

S.M. Kirov Military Medical Academy; Institute of Experimental Medicine

A S Simbirtsev

Institute of Experimental Medicine; Institute of Experimental Medicine; Research Institute of Highly Pure Biopreparations

N V Aksenova

S.M. Kirov Military Medical Academy

O M Veselova

S.M. Kirov Military Medical Academy

A M Ischenko

Research Institute of Highly Pure Biopreparations

  1. Рождественский Л.М. Актуальные вопросы поиска и исследования противолучевых средств // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2013. - Т. 53. - № 5. - С. 513-520. [Rozhdestvenskiy LM. Aktual’nye voprosy poiska i issledovaniya protivoluchevykh sredstv. Radiats Biol Radioecol. 2013;53(5):513-520. (In Russ.)]
  2. Singh VK, Romaine PL, Seed TM. Medical Countermeasures for Radiation Exposure and Related Injuries: Characterization of Medicines, FDA-Approval Status and Inclusion into the Strategic National Stockpile. Health Phys. 2015;108(6):607-630. doi: 10.1097/HP.0000000000000279.
  3. Kamran MZ, Ranjan A, Kaur N, et al. Radioprotective Agents: Strategies and Translational Advances. Med Res Rev. 2016;36(3):461-493. doi: 10.1002/med.21386.
  4. Гребенюк А.Н., Аксенова Н.В., Петров А.В., и др. Получение различных вариантов рекомбинантного флагеллина и оценка их радиозащитной эффективности // Вестник Российской военно-медицинской академии. - 2013. - Т. 43. - № 3. - С. 75-80. [Grebenyuk AN, Aksenova NV, Petrov AV, et al. Expression of different variants of recombinant flagellin and study of their radioprotective efficacy. Vestnik Rossiiskoi voenno-meditsinskoi akademii. 2013;43(3):75-80. (In Russ.)]
  5. Гребенюк А.Н., Легеза В.И. Противолучевые свойства интерлейкина-1. - СПб.: Фолиант, 2012. [Grebenyuk AN, Legeza VI. Protivoluchevye svoystva interleykina-1. Saint Petersburg: Foliant; 2012. (In Russ.)]
  6. Боровиков В.П. Популярное введение в современный анализ данных в системе Statistica. - M.: Горячая линия-Телеком, 2013. [Borovikov VP. Populyarnoe vvedenie v sovremennyy analiz dannykh v sisteme STATISTICA. Moscow: Goryachaya liniya-Telekom; 2013. (In Russ.)]
  7. Мурзина Е.В., Софронов Г.А., Аксенова Н.В., и др. Экспериментальная оценка противолучевой эффективности рекомбинантного флагеллина // Вестник Российской военно-медицинской академии. - 2017. - Т. 59. - № 3. - С. 122-128. [Murzina EV, Sofronov GA, Aksenova NV, et al. Experimental estimation of the radioprotective efficiency of recombinant flagellin. Vestnik Rossiiskoi voenno-meditsinskoi akademii. 2017;59(3):122-128. (In Russ.)]
  8. Симбирцев А.С. Интерлейкин-1. Физиология, патология, клиника. - СПб.: Фолиант, 2011. [Simbirtsev AS. Interleykin-1. Fiziologiya, patologiya, klinika. Saint Petersburg: Foliant; 2011. (In Russ.)]
  9. Vijay-Kumar M, Aitken JD, Sanders CJ, et al. Flagellin treatment protects against chemicals, bacteria, viruses, and radiation. J Immunol. 2008;180(12):8280-8285. doi: 10.4049/jimmunol.180.12.8280.
  10. Burdelya LG, Krivokrysenko VI, Tallant TC, et al. An agonist of toll-like receptor 5 has radioprotective activity in mouse and primate models. Science. 2008;320(5873):226-230. doi: 10.1126/science.1154986.
  11. Krivokrysenko VI, Toshkov IA, Gleiberman AS, et al. The Toll-Like Receptor 5 Agonist Entolimod Mitigates Lethal Acute Radiation Syndrome in Non-Human Primates. PLoS One. 2015;10(9):e0135388. doi: 10.1371/journal.pone.0135388.
  12. Singh VK, Garcia M, Seed TM. A review of radiation countermeasures focusing on injury-specific medicinals and regulatory approval status: part II. Countermeasures for limited indications, internalized radionuclides, emesis, late effects, and agents demonstrating efficacy in large animals with or without FDA IND status. Int J Radiat Biol. 2017;93(9):870-884. doi: 10.1080/09553002.2017.1338782.
  13. Krivokrysenko VI, Shakhov AN, Singh VK, et al. Identification of granulocyte colony-stimulating factor and interleukin-6 as candidate biomarkers of CBLB502 efficacy as a medical radiation countermeasure. J Pharmacol Exp Ther. 2012;343(2):497-508. doi: 10.1124/jpet.112.196071.
  14. Lopez-Yglesias AH, Zhao X, Quarles EK, et al. Flagellin induces antibody responses through a TLR5- and inflammasome-independent pathway. J Immunol. 2014;192(4):1587-1596. doi: 10.4049/jimmunol.1301893.
  15. Hoffmann A, Baltimore D. Circuitry of nuclear factor kappa B signaling. Immunol Rev. 2006;210:171-186. doi: 10.1111/j.0105-2896.2006.00375.x.
  16. Chen H, Wang ZD, Chen MS, et al. Activation of Toll-like receptors by intestinal microflora reduces radiation-induced DNA damage in mice. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 2014;774:22-28. doi: 10.1016/j.mrgentox.2014.09.001.
  17. Li W, Ge C, Yang L, et al. CBLB502, an agonist of Toll-like receptor 5, has antioxidant and scavenging free radicals activities in vitro. Int J Biol Macromol. 2016;82:97-103. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2015.10.033.
  18. Wang Z-D, Qiao Y-L, Tian X-F, et al. Toll-like Receptor 5 Agonism Protects Mice from Radiation Pneumonitis and Pulmonary Fibrosis. Asian Pac J Cancer Prev. 2012;13(9):4763-4767. doi: 10.7314/apjcp.2012.13.9.4763.
  19. Zhou S-X, Li F-S, Qiao Y-L, et al. Toll-like Receptor 5 Agonist Inhibition of Growth of A549 Lung Cancer Cells in Vivo in a Myd88 Dependent Manner. Asian Pac J Cancer Prev. 2012;13(6):2807-2812. doi: 10.7314/apjcp.2012.13.6.2807.
  20. Toshkov IA, Gleiberman AS, Mett VL, et al. Mitigation of Radiation-Induced Epithelial Damage by the TLR5 Agonist Entolimod in a Mouse Model of Fractionated Head and Neck Irradiation. Radiat Res. 2017;187(5):570-580. doi: 10.1667/RR14514.1.
  21. Liu Z, Lei X, Li X, et al. Toll-like receptors and radiation protection. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2018;22(1):31-39. doi: 10.26355/eurrev_201801_14097.
  22. Brackett CM, Kojouharov B, Veith J, et al. Toll-like receptor-5 agonist, entolimod, suppresses metastasis and induces immunity by stimulating an NK-dendritic-CD8+ T-cell axis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113(7):E874-883. doi: 10.1073/pnas.1521359113.
  23. Kojouharov BM, Brackett CM, Veith JM, et al. Toll-like receptor-5 agonist Entolimod broadens the therapeutic window of 5-fluorouracil by reducing its toxicity to normal tissues in mice. Oncotarget. 2014;5(3):802-814. doi: 10.18632/oncotarget.1773.

Views

Abstract - 101

PDF (Russian) - 1

Cited-By


PlumX

Refbacks

  • There are currently no refbacks.

Copyright (c) 2018 Murzina E.V., Sofronov G.A., Simbirtsev A.S., Aksenova N.V., Veselova O.M., Ischenko A.M.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.

This website uses cookies

You consent to our cookies if you continue to use our website.

About Cookies