Effect of cholinotropic agents to change the content of oxygen triplet forms of liver tissue and the ability of the liver homogenate to produce active oxygen in rat cooling

Cover Page

Abstract


The method of polarographic analysis of elements in the tissue solutions of living organisms, and the method of checking the ability of the liver homogenate to produce active forms of oxygen are among the methods for assessing the content of triplet forms of oxygen in the tissue and the ability of the tissue homogenate to initiate lipid peroxidation (POL) after a cold load and administration of cholinotropic agents to rats. In the study, the content of triplet form of oxygen of liver homogenate and the ability of the liver homogenate to produce active oxygen in the period of 3 hour and 5 days cooling of experimental animals were determined. The effect of cholinotropic agent accumulating the endogenous acetylcholine in liver tissue, pharmacological agents that stimulate and block the work of muscarine-sensitive cholinoreactive structures of hepatocyte plasmatic membranes with the assessment of their impact on the content of triplet forms of oxygen, the ability of the liver homogenate to produce active oxygen in supercooling of animals were investigated. Neostigmine on the background of 3 hours cold exposure led to a decrease in the content of triplet forms of oxygen but increased the ability of the liver homogenate to produce active forms of oxygen. Pilocarpine and atropine on the background of cooling animals in 5 days period caused the manifestation of reciprocity as in 3 minutes, so as in 30 minutes of experiment for the determination of triplet forms of oxygen of the liver tissue. Besides pilocarpine and atropine reduced the ability of liver tissue to produce active forms of oxygen. The obtained results indicate the change in the content of triplet forms of oxygen in the liver tissue when pilocarpine and atropine administrated to animals on the backdrop of 5 days cooling. Additionally the results show that the injection of neostigmine to animals on the background of 3 hours cooling promotes the increase of active forms of oxygen.


Изменение парциального напряжения триплетной формы кислорода (ТФК) в тканевой среде способствует изменению содержания продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в тканях [1]. Способность ТФК формировать π-связь с атомами углерода в энергетически нестабильных участках полиненасыщенных жирных кислот (PUFAs) C20 приводит к созданию условий для делокализации двойных связей [2] c последующим возникновением в жирно-кислотных фрагментах PUFAs C20 участков углеродцентрированных радикалов [3, 4].

В присутствии ионов щелочноземельных металлов (Ca2+), металлопротеидов с двухвалентными (Fe2+), трехвалентными (Fe3+) формами железа [5, 6] ТФК в тканевой среде способны менять энергетическую конфигурацию наружных орбиталей с проявлением возможности присоединения к органическим структурам тканей без затраты дополнительной энергии.

Так, орбитали 2РY и 2РZ ТФК способны включать эквивалент энергии, равный энергии электрона, что приводит ТФК в состояние супероксидного анион-радикала [7]. Подобное явление отмечается в ферментных комплексах NADP • H оксидаз (глюкозооксидаза, ксантиноксидаза, альдегидоксидаза), металлофлавопротеидов эндотелия сосудов печени [8], синтаз семейства CYP — P450 2С9 [9], ферментов семейства липооксигеназ (LOX) [10], синтаз оксида азота (NOS) эндотелиальных клеток стенок сосудов [11].

Контакт супероксидного анион-радикала с подобной молекулой тканевой среды [12] в реакции дисмутации сопровождается формированием пула Н2О2 в присутствии металлов переменной валентности, индуцирующей образование гидроперекисных радикалов [13]. Создание подобных метаболитов кислорода в тканевой среде трактуется как формирование активных форм кислорода (АФК) [15].

Отмечено, что в условиях длительной холодовой нагрузки модели созданных центральных, периферических М-, Н-холиномиметиков введение животным центральных и периферических М-, Н-холиноблокаторов приводит к изменению поглощения кислорода животными [14], отмечено, что и введение в ткань печени АЦХ in situ сопровождается изменениями в содержании ТФК гомогената печени [15]. Однако вопрос о влиянии на содержание ТФК в ткани печени, способности ткани печени генерировать АФК при введении холинотропных средств на фоне охлаждения животных не выяснялся, поэтому задачей в проведенной работе было определение изменений, связанных с влиянием неостигмина, вводимого на фоне 3-часового охлаждения животных, выяснение эффектов, вызываемых пилокарпином, атропином на фоне 5-дневного охлаждения животных, определение содержания ТФК в ткани печени, способности гомогената печени продуцировать АФК.

Методы исследования

Выбор животных. Все исследования проводились на беспородных крысах-самцах массой до 200 г. Животные перед началом экспериментов не менее 10 дней содержались в идентичных условиях вивария с соблюдением режима кормления, тепла, обеспечения питьевого режима [16]. Животные распределялись на группы: контроль-1 (интактные) — животные содержались в стандартных условиях вивария; контроль-2 (холод) — подвергались только охлаждению. Животным групп контроль-1 и контроль-2 в одно и то же время суток (11 ч дня) внутрибрюшинно (в/бр) вводили только физиологический раствор. Животным опытных групп за 30 мин до охлаждения в/бр вводили фармакологические агенты в зависимости от поставленных задач. Режим холодовой нагрузки создавался животным опытных групп и животным группы контроль-2 (холод) в климатокамере при температуре –12 °С на протяжении 3 ч и по 3 ч в течение пяти дней [17]. Животные при охлаждении находились в свободном состоянии. В работе климатокамеры предусматривался световой режим и подача воздуха для предупреждения гипоксии [18]. Контролем служили животные, находившиеся в климатокамере при температуре 20–22 °С и не подвергавшиеся воздействию холода.

Аналитические методы. Из аналитических методов в данном разделе работы применяли определение содержания ТФК гомогената печени (рис. 1) методом полярографического анализа элементов, находящихся в растворах тканей живых организмов [19].

 

Рис. 1. Запись изменений тока в ячейке электролизера после добавления гомогената печени при регистрации триплетной формы кислорода

 

Определение способности гомогената печени продуцировать активные формы кислорода. Используя акцептирование эквивалента энергии, равного электрону, оксидоредуктазами, находящимися в растворе измерительной электролизной ячейки (ИЭЯ), с дальнейшей передачей энергетического эквивалента на кислород, находящегося в водной фазе, и формированием супероксидного аниона, гидроксильных радикалов судили о способности гомогената печени продуцировать АФК (рис. 2) по изменению величины тока на выходе из ИЭЯ [5, 15].

Рис. 2. Запись тока в измерительной электролизной ячейке, определяющего способность гомогената печени продуцировать активные формы кислорода


Фармакологические методы. Для возбуждения периферических мускарино-чувствительных холинорецепторов (mAChRs) плазматических мембран гепатоцитов эндогенным ацетилхолином (АЦХ) был выбран неостигмин [20, 21]. В дозе 0,2 мг/кг неостигмин вызывает саливацию [22], лакримацию [23], о возбуждении периферических никотинчувствительных холинорецепторов (nAChRs) судили по единичным сокращениям поперечнополосатой мускулатуры животных [24].

Повторение профиля экспериментов, связанного с применением прямого неселективного М-холиномиметика пилокарпина (10 мг/кг) и М-холиноблокатора атропина (1 мг/кг) на фоне охлаждения животных, обосновывалось устоявшимся сочетанием фармакологических агентов в определении феномена «реципрокность» [25, 26]. К тому же сочетание фармакологических агентов пилокарпина, атропина применяли и в изучении феномена «окислительный стресс» [27, 28].

Результаты исследований

Полученные результаты свидетельствуют, что содержание ТФК в ткани печени у животных группы контроль-2 (холод) в условиях ٣-часовой холодовой нагрузки увеличивалось на ٥,٧ % при сравнении с результатами групп животных контроля-١ (интактные). Способность гомогената печени продуцировать АФК у животных группы контроля-٢ после ٣-часового охлаждения возрастала в 1,13 раза (табл. 1). Введение же неостигмина на фоне данного режима охлаждения животных снижало содержание ТФК на ٧,٢ ٪ при сравнении с данными животных группы контроль-٢, но способность гомогената печени продуцировать АФК, в отличие от содержания ТФК в ткани печени, увеличивалась на ٦ ٪.

 

Таблица 1. Триплетная, активные формы кислорода гомогената печени после 3-часового охлаждения животных и введения неостигмина

Показатели

Триплетная форма

кислорода (ммоль O2/мл гомогената)

Активные формы кислорода  (10-6 Амп /мл гомогената)

1-я группа, контроль-1 (интактные), n = 10

349,3 [328,6– 376,7]

8,68 [8,2–9,48]

2-я группа, контроль-2 (холод), n = 10

369,5 [365,1–411,6]*

9,81 [9,38–10,35]*

3-я группа, опыт (холод + неостигмин), n = 10

343,0 [328,4–376,6]**

10,41 [10,12–10,61]*, **

Примечание. *p < 0,05 в сравнении с контролем-1 (интактные); **p < 0,05 в сравнении с контролем-2 (холод). Здесь и в табл. 2 количественные значения представлены в виде медианы и процентилей (5-й и 95-й процентили)

 

Пилокарпин, вводимый животным в течение 5 дней охлаждения, к 3-й минуте экспериментов при снятии показаний ТФК гомогената печени в ИЭЯ приводил к увеличению ТФК на 10,7 % (табл. 2), а к 30-й минуте экспериментов отмечалось снижение ТФК в ткани печени на 8,2 %. При введении же животным атропина отмечалось, что к 3-й минуте регистрации показаний с ИЭЯ содержание ТФК снижалось на 2,1 % (см. табл. 2), а к 30-й минуте эксперимента отмечалось увеличение ТФК в 1,2 раза при сравнении с данными животных группы контроль-2. При определении же способности гомогената печени продуцировать АФК введение животным пилокарпина и атропина на фоне 5 дней охлаждения достоверно снижало способность гомогената печени индуцировать АФК.

 

Таблица 2. Содержание триплетной формы кислорода в гомогенате печени, способность гомогената печени продуцировать активные формы кислорода после 5 дней охлаждения животных и введения пилокарпина, атропина

Показатели

Триплетная форма кислорода на ٣-й минуте эксперимента  (ммоль O2 /мл гомогената)

Триплетная форма кислорода на ٣٠-й минуте эксперимента (ммоль O2 /мл гомогената)

Активные формы  кислорода (АФК) (10–6 Амп/мл гомогената)

1-я группа, контроль-1

(интактные), n = 10

287,2 [285,3–289,1]

309,5 [307,3–311,6]

7,69 [6,85–8,54]

2-я группа, контроль-2 (холод), n = 10

277,85 [275,8–279,3]

*

463,35 [456,1–471,5]

*

10,01 [9,70–10,51]

*

3-я группа, опыт-1

(холод + пилокарпин, 10 мг/кг), n = 10

307,8 [304,2– 311,2]

*, **

428,3 [400,5–442,5]

*, **

9,03 [8,09–9,93]

*, **

4-я группа, опыт-2 (холод + атропин, 1 мг/кг), n = 10

272,2 [270,1–273,6]

*, **

559,0 [534,8–581,5]

*, **

9,609 [9,48–9,73]

*, **

Примечание. *p < 0,05 в сравнении с контролем-1 (интактные); **p < 0,05 в сравнении с контролем-2 (холод)

 

Таким образом, охлаждение животных в течение 3 ч приводило к увеличению содержания ТФК в ткани печени, и при этом отмечалась способность гомогената печени увеличивать продукцию АФК. Неостигмин, вводимый животным на фоне 3-часового действия холода, приводил к уменьшению содержания ТФК, но увеличивал способность гомогената печени продуцировать АФК при сравнении с данными животных, подвергавшихся только охлаждению.

Пилокарпин на фоне 5 дней охлаждения к 3-й минуте снятия показаний с ИЭЯ вызывал увеличение содержания ТФК, а атропин — снижение. К 30-й минуте экспериментов у животных с введением пилокарпина регистрировалось снижение содержания ТФК в ткани печени, а при введении атропина — увеличение. При определении способности гомогената печени продуцировать АФК введение животным пилокарпина и атропина в течение 5 дней охлаждения показывало однонаправленный эффект — снижение способности гомогената печени индуцировать продукцию АФК.

Обсуждение полученных результатов

В проведенных исследованиях было показано, что введение холинотропных средств (неостигмин, пилокарпин и атропин) в периоды охлаждения животных (3 ч и 5 дней по 3 ч) влияют на содержание ТФК в ткани печени, влияют на способность гомогената печени продуцировать АФК.

Определение ТФК в ткани печени в группе животных, связанных с введением пилокарпина на фоне 5 дней охлаждения, показывало изменения: к 3-й минуте экспериментов при регистрации показаний с ИЭЯ отмечалось увеличение ТФК, а к 30-й минуте — снижение. Подобные изменения в содержании ТФК в ткани печени при введении животным пилокарпина, на наш взгляд, можно объяснить изменением содержания ТФК в структурах органических соединений ткани печени [29]. Факт изменения ТФК в ткани печени при введении животным пилокарпина связываем с активностью М-холинореактивных структур плазматических мембран гепатоцитов. Подтверждением предлагаемого мнения может служить проявление реципрокности, регистрируемое в ИЭЯ, при введении животным пилокарпина и атропина на фоне 5 дней охлаждения.

Феномен реципрокности при оценке способности гомогената печени индуцировать АФК на фоне введения животным пилокарпина и атропина в период 5 дней охлаждения нами не был отмечен, но накопление эндогенного АЦХ неостигмином в ткани печени на фоне 3-часового охлаждения животных приводило к увеличению способности гомогената печени продуцировать АФК. Сопоставление фактов, полученных в эксперименте (снижение способности гомогената печени генерировать АФК при введении животным пилокарпина, атропина на фоне 5 дней охлаждения, но увеличение способности гомогената печени индуцировать АФК при введении животным неостигмина в период 3-часового охлаждения), позволяет высказать предположение о возможном участии никотинчувствительных ацетилхолиновых участков лиганд проводящих ионных каналов [30] плазматической мембраны гепатоцитов в подготовке ткани печени к индуцированию АФК в период переохлаждения животных через накопление эндогенного АЦХ.

О влиянии mAChRs гладкой мускулатуры бронхов на содержание ТФК в ткани печени свидетельствует сопоставление результатов экспериментов, связанных с оценкой содержания ТФК в ткани печени при введении животным пилокарпина на фоне 5 дней охлаждения и введении непрямого М-, Н-холиномиметика неостигмина в режиме 3-часового охлаждения. Отмечаются однонаправленные изменения: снижение содержания ТФК в ткани печени (к 30-й минуте снятия показаний с ИЭЯ при введении животным пилокарпина и снижение ТФК на протяжении всего отрезка регистрации ТФК в ИЭЯ при введении неостигмина).

Таким образом, на основании данных по определению содержания ТФК в ткани печени, способности гомогената печени продуцировать АФК при введении холинотропных средств (неостигмин, пилокарпин, атропин) на фоне 3-часового и 5 дней охлаждения животных и в результате обсуждения полученных результатов можно сделать вывод о влиянии холинотропных средств на содержание ТФК в ткани печени и о способности холинотропных средств (неостигмин) вызывать изменения в индуцировании АФК тканью печени в условиях формирования ПОЛ при холодовых нагрузках.

Viktor I Tikhanov

Amur State Medical Academy

Author for correspondence.
Email: tikhanov@yandex.ru

Russian Federation PhD (Pharmacology), Assistant Professor, Dept. of. Hospital Therapy and Clinical Pharmacology

  1. Robets J. 2nd, Milne GL. Isoprostane. J Lipid Res. 2009;50(suppl.):219-223.
  2. Caldwell SE, Mills KA. Mechanisms of free radical oxidation of unsaturated lipids. Lipids.1995;30:277-290.
  3. Szori M, Imre G, Viskolcz C, et al. Nonenzymatic pathway of PUFAs oxidation. A first principles study of the reactions of OH radicals with 1,4-pentadiene and arachidonic acid. Journal of Chemical Theory and Computation. 2008;4(9):1472-1479.
  4. Qian SY, Yue GH, Tomer KB, et al. Identification of all classes of spin-trapped carbon — centered radicals in soybean lipoxygenase-dependent lipid peroxidation of omega-6 polyunsaturated fatty acids via LC / ESR, LC / MS, and trandent MS. Free Radical Biology and Medicine. 2003;34(8):1017-1028.
  5. Метелица Д.И. Активация кислорода ферментными системами. — М.: Наука, 1982. [Metelitsa DI. Aktivatsiya kisloroda fermentnymi sistemami. Moscow: Nauka; 1982. (In Russ.)]
  6. Chellan P, Sadler PJ. The elements of life and medicines. Philos Trans A Math Phys Eng Sci. 2015;373:20-37. doi: 10.1098/ rsta.2014.0182.
  7. Babior BM. Superoxide: a two-edged sword. Braz J Med Biol Res. 1997;30(2):141-155.
  8. Menashian A, Bulkley GB. The physiology of endothelial xanthine oxidase: from urate catabolism to reperfusion injury to inflammatory signal transduction. Microcirculation. 2002;9(3):161-175.
  9. Fleming I, Michaelis VR, Bredenkotter D, et al. Endothelium — derived hyperpolarizing factor synthase (Cytochrom P4502C9) is a functionally significant sourse of reactive oxygen species in coronary arteries. Circ Res. 2001;88:44-51.
  10. Kukreja RC, Kontes HA, Hess ML, et al. PGH-synthase and lipoxygenase generate superoxide in the presence of NADH or NADPH . Circ Res. 1986;59:612-619.
  11. Banersachs BA, Linz JW. Endothelial dysfunction coincides with an enhanced nitric oxide synthase expression and superoxide anion production. Hypertension. 1997;30(4):934-941.
  12. Fridovich I. Superoxide radical and superoxide dismutases. Annual Review of Biochemistry.1995;54:97-112.
  13. Buerk DG. Mathematical modeling of the interaction between oxygen, nitric oxide and superoxide. Adv Exp Med Biol. 2009;645:7-12.
  14. Тиханов В.И. Влияние центральных и периферических М-, Н-холиномиметиков и М-, Н-холиноблокаторов на формирование холодовой адаптации: Дис. … канд. мед. наук. — Л., 1988. [Tikhanov VI. Vliyanie tsentral’nykh i perifericheskikh M-, N-kholinomimetikov i M-, N-kholinoblokatorov na formirovanie kholodovoi adaptatsii. [dissertation] Leningrad; 1988. (In Russ.)]
  15. Тиханов В.И., Лосев Н.А., Доровских В.А., и др. Триплетная и активная формы кислорода ткани печени экспериментальных животных на фоне охлаждения и введения ацетилхолина в ткань печени in situ // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. – 2015. – Вып. 56. – С. 107–112. [Tikhanov VI, Losev NA, Dorovskikh VA, et al. Tripletnaya i aktivnaya formy kisloroda tkani pecheni eksperimental’nykh zhivotnykh na fone okhlazhdeniya i vvedeniya atsetilkholina v tkan’ pecheni in situ. Byulleten’ fiziologii i patologii dykhaniya. 2015;56:107-112. (In Russ.)]
  16. Bramhal M, Florez, Vargas O, Stevens R. Quality of methods reporting in animal models of colitis. Inflamm Bowel Dis. 2015;21(6):1248-1259.
  17. Тиханов В.И., Лосев Н.А., Доровских В.А., и др. Изменение продуктов и субстратных составляющих перекисного окисления липидов в ткани печени на фоне холодовой нагрузки и введения непрямых мускарино-чувствительных и никотино-чувствительных холиномиметиков // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. – 2013. – Вып. 50. – С. 61–67. [Tikhanov VI, Losev NA, Dorovskikh VA, et al. Izmenenie produktov i substratnykh sostavlyayushchikh perekisnogo okisleniya lipidov v tkani pecheni na fone kholodovoi nagruzki i vvedenii nepryamykh muskarino-chuvstvitel’nykh i nikotino-chuvstvitel’nykh kholinomimetikov. Byulleten’ fiziologii i patologii dykhaniya. 2013;50:61-67. (In Russ.)]
  18. Epstein CD, Haghenbeck KT. Bedside Assessment of Tissue Oxygen Saturation Monitoring in Critically III Adults: An Integrative Review of the Literature. Crit Care Res Pract. 2014;14:683-709.
  19. Гейеровский Я., Кута Я. Основы полярографии. – М.: Мир, 1965. – 559 с. [Geierovskii Ya, Kuta Ya. Osnovy polyarografii. Moskow: Mir; 1965. (In Russ.)]
  20. Nowell PT, Scott CA, Wilson A. Hydrolysis of neostigmine by plasma cholinesterase. Br J Pharmacol Chemother. 1962;19(3):498-502.
  21. Yu Q — Sh, Holloway HW, Luo W, et al. Long-acting anticholinesterases for myasthenia gravis : synthesis and activities of quaternary phenylcarbamates of neostigmine, pyridostigmine and physostigmine. Bioorg Med Chem. 2010;18(13):46870-46930.
  22. Аничков С.В. Избирательное действие медиаторных средств. Медицина, 1974. — 291 с. [Anichkov SV. Izbiratel’noe deistvie mediatornykh sredstv. Meditsina; 1974. 291 p. (In Russ.)]
  23. Лосев Н.А., Сапронов Н.С., Хныченко Л.К., и др. Фармакология новых холинергических средств (фармакология — клинике). – СПб.: Арт-экспресс, 2015. – 368 с. [Losev NA, Sapronov NS, Khnychenko LK, et al. Farmakologiya novykh kholinergicheskikh sredstv (farmakologiya — klinike). Saint Petersburg: Art-ekspress; 2015. 368 p. (In Russ.)]
  24. Лосев Н.А. Влияние холиномиметиков ареколина и никотина на лимбико-ретикулярный комплекс. Ретикулярная функция биогенных аминов. – Л., ١٩٧٠. [Losev NA. Vliyanie kholinomimetikov arekolina i nikotina na limbiko-retikulyarnyi kompleks. Retikulyarnayafunktsiya biogennykh aminov. Leningrad; 1970. (In Russ.)]
  25. Лосев Н.А. Фармакология – клинике (с учетом взаимодействия М- и Н-холинергических механизмов). Актовая речь на заседании ученого совета Института экспериментальной медицины. – СПб., 2007. – 44 с. [Losev NA. Farmakologiya — klinike (s uchetom vzaimodeistviya M- i N-kholinergicheskikh mekhanizmov). Aktovaya rech’ na zasedanii Uchenogo soveta Instituta Eksperimental’noi Meditsiny. Saint Petersburg; 2007. 44 p. (In Russ.)]
  26. Brown DM, Quinton RM. The assay of anti-acetylcholine agents for antagonism of pilocarpine — induced salivation in rabbits. Br J Pharmacol Chemother. 1957;12(1):53-60.
  27. De Vore NM, Meneely KM, Bart AG, et al. Structural comparison of cytochromes P 450 2A6, 2A13, and 2E1 with pilocarpine. FEBS J. 2012;279(9):1621-1631.
  28. Yaday P, Jadhav SE, Kumar V, et al. Protective efficacy of 2 - PAMCL, atropine and circumin against dichlovos induced toxicity in rats. Inter discip Toxicol. 2012;5(1):1-8.
  29. Тиханов В.И., Лосев Н.А., Доровских В.А., и др. Продукты и субстратные составляющие перекисного окисления липидов ткани печени при введении ацетилхолина in situ // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. — 2015. — Вып. 55 . – С. 101–107. [Tikhanov VI, Losev NA, Dorovskikh VA, et al. Produkty i substratnye sostavlyayushchie perekisnogo okisleniya lipidov tkani pecheni pri vvedenii atsetilkholina in situ. Byulleten’ fiziologii i patologii dykhaniya. 2015;55:101-107. (In Russ.)]
  30. Christopher L, Gunduz ShM, Scialis JR, et al. Metabolism and disposition of a selective α 7 nicotinic acethylcholine receptor agonist in humans. American Society for Pharmacology and Experimental therapeutics. 2007;35(7):1188-1195.

Views

Abstract - 315

PDF (Russian) - 229

Cited-By


PlumX


Copyright (c) 2016 Tikhanov V.I.

Creative Commons License
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.